Funktionelle Dynamik des Retinalchromophors in verschiedenen Rhodopsinen

Functional dynamics of retinal proteins

Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Dynamik des Retinalchromophors in archaealen, bakteriellen sowie eukaryotischen Retinalproteinen zeitaufgelöst zu untersuchen und so Informationen über die unterschiedlichen
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Dynamik des Retinalchromophors in archaealen, bakteriellen sowie eukaryotischen Retinalproteinen zeitaufgelöst zu untersuchen und so Informationen über die unterschiedlichen lichtgesteuerten zyklischen Reaktionen zu erhalten. Für das bakterielle Proteorhodopsin (PR) wurde die Primärdynamik im sichtbaren Spektralbereich unter D2O-Bedingungen bei unterschiedlichen pD-Werten untersucht. Es zeigte sich, dass das isomerisierte K-Photoprodukt mit zwei Zeitkonstanten im Bereich von 1 ps und 20 ps gebildet wird. Der Vergleich mit Messungen in H2O erlaubte es den kinetischen Isotopeneffekt für die Deaktivierung des S1-Zustandes zu berechnen. Die Ergebnisse weisen dabei auf unterschiedliche Wasserstoffbrückenmuster unter sauren und alkalischen Bedingungen hin. Um diesem Resultat weiter nachzugehen, wurde die D97N-Mutante untersucht, bei der der primäre Protonenakzeptors ungeladen vorliegt. Die gefundene Primärdynamik von PR D97N läuft nur unwesentlich langsamer ab als die des Wildtyp-Proteins bei pD 6,4. Um weitergehende Einsichten in die Primärdynamik von PR zu erlangen, wurden am Wildtyp-Protein sowie der D97N-Mutante transiente Absorptionsmessungen im Bereich der C=C- und C=N-Schwingung des Retinals durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass die Quantenausbeute der K-Bildung unabhängig vom pD-Wert ist. In einem weiteren Schritt wurde der Einfluss des hochkonservierten His-75 auf die Isomerisierungsdynamik untersucht. Hierfür wurden die Mutanten H75N und H75M verwendet. Die Kurzzeitmessungen lassen keinen ausgeprägten Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik erkennen. Auch der nachfolgende Teil des Photozyklus war im Blickpunkt dieser Arbeit. Die Tieftemperaturstudien im sichtbaren Spektralbereich erlaubten das in kinetischen Messungen nicht beobachtete M-Intermediat des sauren Photozyklus nachzuweisen. Um strukturelle Einblicke in den Photozyklus zu erlangen und die am Pumpvorgang beteiligten Aminosäuren zu identifizieren, wurden nachfolgend Tieftemperaturuntersuchungen im infraroten Spektralbereich durchgeführt. Die Implementierung eines Faserspektrometers in den Strahlengang des FTIR-Aufbaus erlaubte hierbei die simultane Aufnahme der lichtinduzierten Änderungen der Bandenposition im sichtbaren Spektralbereich und der Änderungen der Proteinstruktur sowie der Seitenketten. Für den M-Zustand bei pH 5,1 konnte gezeigt werden, dass auch hier eine Aspartat- oder Glutamat-Seitenkette als Protonenakzeptor fungiert. Weiterhin konnte dargelegt werden, dass der Photozyklus von PR nicht nur vom pKa-Wert des Protonen-akzeptors Asp-97 abhängt, sondern von einem Zusammenspiel mehrerer pH-abhängiger Gleichgewichte, da schon kleinste Änderungen des pH-Werts im Bereich des pKa großen Einfluss auf die beobachteten Differenzspektren sowie die Dynamik haben. Auch für das in jüngster Vergangenheit zur optogenetischen Kontrolle neuronaler Netze eingesetzte eukaryotische Retinalprotein Channelrhodopsin-2 (ChR-2) wurden umfangreiche Photozyklusstudien durchgeführt. Mit Hilfe von transienter Absorptionsspektroskopie im Sichtbaren sowie der Fluoreszenz-aufkonvertierung konnte gezeigt werden, dass der angeregte Zustand monoexponentiell mit 0,4 ps zerfällt. Die Reaktion setzt sich mit einem Kühlprozess und kleineren Änderungen der Linienbreite des K-Photoprodukts fort. Durch die schnelle Deaktivierung des angeregten Zustands war es zudem möglich die direkten Auswirkungen der Retinalisomerisierung auf die Proteinumgebung zu beobachten. Die Vielzahl ausgeprägter Differenzbanden zeigte hierbei, dass neben der schnellen Isomerisierung auch der Energietransfer der im Retinal gespeicherten Überschussenergie an das Protein sehr effizient ist. Über Blitzlichtphotolyseexperimente konnte die Langzeitdynamik des ChR-2-Photozyklus erstmals mit einer sub-µs-Zeitauflösung charakterisiert werden. Neben der für Retinalproteine typischen Abfolge von blau- und rot-verschobenen Intermediaten, ist der Photozyklus mit einer Dauer von etwa 5 s signifikant langsamer als der gemeinhin schon langsame Zyklus der sensorischen Retinalproteine. Um die Aktivierungs-barrieren des ChR-2-Photozyklus zu untersuchen, wurden weiterhin temperaturabhängige Messungen durchgeführt. Diese ergaben, dass der Photozyklus durch entropische Faktoren bestimmt wird. In einem letzten Ansatzpunkt wurde die Imidazol-Abhängigkeit der Langzeitdynamik des ChR-2-Photozyklus untersucht. Es zeigte sich, dass die Dynamik um die De- und Reprotonierung stark von diesem externen Donor beeinflusst wird. Es wurde jedoch nicht nur eine Beschleunigung der Reprotonierungsreaktion beobachtet, sondern auch der molekulare Mechanismus scheint sich nach Zugabe von Imidazol geändert zu haben. Diese Effekte können am ehesten durch eine Verstärkung des Histidin-Donor-Effekts durch das strukturell verwandte Imidazol erklärt werden. Genau dieser Einfluss externer Donor-Moleküle stand ebenfalls in einer Kurzzeit-Studie archaealer Retinalproteine im Fokus. Vorausgegangene Studien konnten zeigen, dass die Zugabe von Azid-Anionen die Isomerisierungsdynamik sowie den nachfolgenden spektral stillen Übergang der Protonenakzeptor-mutante von SRII D75N beeinflusst. Die vorliegende Arbeit stellte heraus, dass dieser Effekt ein einzigartiges Merkmal dieser Mutante ist. Abschließend wurde überdies die Bedeutung des in der Zelle in 2:2-Stöchiometrie beobachteten Transducerkomplexes auf die Primärreaktion von SRII untersucht. Es zeigte sich, dass dieser keinen Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik aufweist, was eine wichtige Information bezüglich der Signalweitergabe sensorischer Retinalproteine ist.
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The aim of this PhD work was to gain information on the photocycle properties of archaeal, bacterial and eukaryotic retinal proteins by means of time-resolved spectroscopy in the visible and the infrared. For the bacteri
The aim of this PhD work was to gain information on the photocycle properties of archaeal, bacterial and eukaryotic retinal proteins by means of time-resolved spectroscopy in the visible and the infrared. For the bacterial proton pump proteorhodopsin (PR) pump-probe-measurements in the visible were performed under D2O conditions. The K photoproduct is formed with two time constants in the range of ~1 ps and ~20 ps. The biphasic excited state deactivation pathway was found to be less dependent on the pD value than on the pH value illustrating noticeable differences in the hydrogen bonding network under both pH conditions. This was further validated by the investigation of the D97N mutant which serves as a model system for PR with protonated Asp-97. The obtained isomerization dynamics closely resembles the one under acidic conditions. To get direct structural insights into the isomerization dynamics ultrafast infrared spectroscopy was performed in the region of the C=C- and C=N-stretching vibration of the chromophore. It could be shown that the quantum yield of the K intermediate formation is independent of the pH-value. In a further step the influence of the highly conserved histidine residue on the isomerization properties was investigated. For this purpose two mutants were studied (H75N and H75M). The primary dynamics is only slightly affected by the mutations. This means that the electrostatic and steric properties as well as the H-bonding network in the vicinity of the retinal Schiff base are not drastically perturbed by the mutation. The subsequent photocycle dynamics was studied by low-temperature spectroscopy. Furthermore, this cryo-trapping approach allowed the observation of the kinetically silent M intermediate at low pH which is essential for the pumping mechanism. To get structural insights into the photocycle reaction and to identify the participating amino acids in the proton translocation pathway low-temperature infrared measurements were performed. The implementation of a fiber spectrometer in the beam path of the FTIR-spectrometer allows the direct comparison of the light induced changes of the visible band position of the chromophore and the alterations in the protein structure as well as side chain protonation changes. At acidic pH it could be shown that another aspartate or glutamate side chain replaces the function of the now protonated Asp-97 as proton acceptor. Furthermore it could be shown that the photocycle is not only determined by the pKa-value of Asp-97, but an interplay of several pH-dependent equilibria, since small pH-changes around the pKa have a high impact on the observed difference bands and their dynamics. Also for the ion channel channelrhodopsin-2 (ChR-2) comprehensive investigations on the photocycle properties were performed. Ultrafast visible absorption and fluorescence spectroscopy reveals that the excited state decays monoexponentially with 400 fs, thereby populating the K photoproduct. The reaction closes with cooling processes (2.7 ps) and slight alterations in the line width of the K state (200 ps). The high resemblance to the dynamics of the archaeal retinal proteins BR and sensory rhodopsin II (SRII) implies that the electrostatic conditions as well as the hydrogen bonding characteristics are very similar for all of these proteins. The primary dynamics should therefore be interpreted within the framework of the well-established BR models. Due to the fast S1-depopulation it was possible to observe the direct effects of the retinal isomerization on the surrounding protein by pump-probe-spectroscopy in the mid-infrared. It could be shown that the excess energy transfer from the retinal to the protein is very efficient. The subsequent photocycle dynamics of ChR-2 was determined by laser flash photolysis. It turned out that the photocycle exhibits the typical BR-like blue and red shifted photointermediates, but is with a turn over rate of 0.2 s-1 significantly longer than the photocycles of the usually slow sensory proteins. To learn about the activation energies of the photocycle temperature dependent measurements were performed. It could be shown that the photocycle is mostly determined by entropic factors. In a last step the influence of imidazole on the long time photocycle dynamics was investigated. It could be shown that imidazole has a strong impact on the de- and reprotonation dynamics of the retinal Schiff base linkage to the protein. Not only an acceleration of the reprotonation dynamics was found, but also a change in the molecular mechanism. An enhancement of the histidine donor moiety by the structurally related imidazole is assumed. The influence of another external donor on the isomerization properties of archaeal retinal proteins was in the focus of a further ultrafast study. Previous measurements could show that the addition of azide accelerates both the isomerization dynamics and a subsequent spectrally silent transition of the proton acceptor mutant of SRII (D75N). This effect was now proven to be a unique feature of the D75N mutant of SRII. The influence of the cognate transducer complex of SRII on the ultrafast isomerization dynamics of the receptor was investigated in a last transient absorption study. No influence on the primary dynamics could be detected, although the transducer is directly hydrogen bonded to the sensory protein in the proximity of the retinal.
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Metadaten
Author:Mirka-Kristin Verhoefen
URN:urn:nbn:de:hebis:30-84082
Referee:Josef Wachtveitl
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/11/05
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/10/28
Release Date:2010/11/05
Tag:Channelrhodopsin; Proteorhodopsin
infrared spectroscopy ; optical spectroscopy ; retinal proteins
SWD-Keyword:Bakteriorhodopsin ; Infrarotspektroskopie ; Optische Spektroskopie ; Sensorrhodopsin
HeBIS PPN:228537134
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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