Development of lentiviral vectors for the gene therapy of HIV infection

Drug toxicity and viral resistance limit long-term efficacy of antiviral drug treatment for HIV
infection. Thus, alternative therapies need to be explored. Previously, group of “Prof. von Laer”
tested the infusion of T
Drug toxicity and viral resistance limit long-term efficacy of antiviral drug treatment for HIV
infection. Thus, alternative therapies need to be explored. Previously, group of “Prof. von Laer”
tested the infusion of T lymphocytes transduced with a retroviral vector (M87o) that expresses an
HIV entry inhibitory peptide (maC46). Gene-modified autologous T cells were infused into 10
HIV-infected patients with advanced disease and multidrug resistant virus during antiretroviral
combination therapy. T cell infusions were tolerated well with no severe side effects. A
significant increase of CD4 counts was observed post infusion. At the end of the one-year
follow-up, the CD4 counts of all patients were still around or above baseline. Gene-modified
cells could be detected in peripheral blood, lymph nodes and bone marrow throughout the oneyear
follow-up, whereby marking levels correlated with the cell dose. No significant changes of
viral load were observed during the first four months. Four of the seven patients that changed
their antiviral drug regimen thereafter responded with a significant decline in plasma viral load.
In conclusion, the transfer of gene-modified cells was safe, led to sustained levels of gene
marking and may improve immune competence in HIV-infected patients with advanced disease
and multidrug resistant virus. However, the low level of gene marking and the lack of substantial
long-term in vivo accumulation of gene-protected cells observed in this trial clearly demonstrate
the requirement for new vectors with new strategy.
In this thesis self‐inactivating lentiviral vectors harboring internal promoters and RNA elements
were therefore evaluated for their potential use in a clinical gene‐therapy trial. The results from
this work provide the basis for the selection of a suitable candidate vector for extensive
preclinical testing. Apart from being capable of transducing non‐dividing cells, lentiviral vectors
incorporate a number of additional features that are of potential value for gene therapeutic
applications. These include a larger packaging capacity, higher titers than γ‐retroviral vectors
and, most importantly, a reduced risk of deregulating cellular genes due to its natural integration
profile. The use of internal promoters to drive expression of the therapeutic transgene maC46
should further improve the safety profile of these new‐generation vectors, while an additional
artificial splice acceptor (SA) into the 5‟UTR of the transgene over all elevate transgene
expression. The rationale for this is that hematopoietic stem and progenitor cells will be
Summary
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protected from enhancer‐mediated transactivation effects and also from potential side effects due
to the aberrant expression of maC46 while at the same time the full clinical benefit for the
patients is maintained.
In order to find a suitable candidate for preclinical studies, two candidate therapeutic vectors
harboring different regulatory elements were selected based on results from pilot experiments.
The internal promoters used to drive expression of codon optimized maC46 were the PGK
promoter and MPSV promoter. This work focuses on the transgene expression levels in
lymphoid cells and antiviral activity. The issues of long term expression, propensity to
methylation mediated silencing of the promoters, and genotoxicity were also touched. In a first
step the performance of different vectors was evaluated in the human T cell lines. Based on
promising data from ex vivo human peripheral blood mononuclear cells, the vector carrying the
MPSV promoter along with intron were selected for in vivo transplantation experiments.
In summary, the ex vivo data suggested the long term survival of lentiviral gene modified cells,
along with maintained expression of introduced genes. It was observed that the expression of
these constructs depends strongly on the activation and differentiation status of the targeted T
cells. This regulation was not linked to any specific promotor. In vivo study shows that maC46
can be introduced into murine multiple hematopoietic lineages via lentiviral vector and expressed
at high levels in their mulilineage progeny, without altering the hematopoiesis. There was no
sign of any kind of hematopoietic or lymphoid malignancies. Although gene-modified
lymphocytes persisted in-vivo, the downregulation of transgene expression was consistent with
the ex-vivo observation. In contrast to that the T cells transplanted group showed delayed
engraftment of donor cells and there was no expression of C46 in blood and lymphatic organs. .
In conclusion, when considering HIV gene therapy focusing CD4+ T cells, potential problems of
T cell activation status as related to the desired clinical effect must be addressed. These results
might open the way for a gene therapy targeting mainly or exclusively activated T cells and
could be exploited for immunostimulatory as well as suppressive approaches.
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Trotz des bemerkenswerten klinischen Erfolgs der vor etwa 15 Jahren eingeführten
Standardbehandlung der HIV-Infektion, HAART (highly active anti retroviral therapy), ist die
Entwicklung alternativer Behandlungsstrategi
Trotz des bemerkenswerten klinischen Erfolgs der vor etwa 15 Jahren eingeführten
Standardbehandlung der HIV-Infektion, HAART (highly active anti retroviral therapy), ist die
Entwicklung alternativer Behandlungsstrategien, weiterhin notwendig, da bisher weder eine
effiziente Impfung noch eine kurative Behandlung entwickelt werden konnte.
Im Zuge der Suche nach neuen Therapieansätzen wurde eine Reihe von zellulären und viralen
Zielstrukturen identifiziert, die essentiell für die HIV Replikation sind und als Ansatzpunkte für
innovative Gentherapiestrategien dienen. Unter anderem wurden bereits RNA-basierte Ansätze
verfolgt, wie z.B. Ribozyme, RNA Fängersequenzen (decoys), antisense mRNAs sowie Strategien
der RNA Interferenz. Auf Proteinebene wurden dominant-negative Virusproteine sowie sog.
Intrabodies (zytoplasmatisch lokalisierte Antikörper) als Therapieansatz verfolgt. Diese Strategien
weisen jedoch immanente Probleme auf, die eine Heilung der HIV Infektion letztlich nicht
herbeiführen können.
Ein weiterer Therapieansatz, der auf der Gabe synthetischer, vom viralen Glykoprotein (gp) 41
abgeleiteter Peptide beruht, inhibiert die HIV Replikation im niedrigen nanomolaren
Konzentrationsbereich. Die sogenannten C-Peptide, in Form von T20 (Enfuvirtide, Fuzeon®) sind
als Medikament zugelassen. Enfuvirtide ist ein synthetisches C-Peptid, das einem 36 Aminosäure
umfassenden Bereich in der Heptad-Repeat (HR) - 2 Domäne in gp41 entspricht. Es bindet an den
HR1 Domänentrimer von gp41, sodass die Formierung des Sechs-Helix-Bündels verhindert und
somit die Fusion der zellulären und viralen Membranen inhibiert wird.
Die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Dorothee von Laer hat in den Jahren 2004-2006 in
zusammenarbeit mit dem Universitäts-klinikum Hamburg Eppenheim eine klinische Phase I/II
Studie durchgeführt, in der autologe T-Zellen von 10 HIV+ Patienten gentherapeutisch in der Art
modifiziert wurden, dass sie eine membranverankerte (ma) Variante eines C-peptids, dem
sogenannten maC46 auf deren Zelloberfläche exprimieren. C46 entspricht, wie T20, einem
Bereich der extrazellulären Domäne des gp41 Proteins ist allerdings N-terminal um zehn
Aminosäuren verlängert und besitzt dadurch verbesserte Eigenschaften in Bezug auf virale
Resistenzmutationen. Die maC46 transduzierten Zellen wurden nach Expansion wieder den
Patienten reinfundiert. Die Transgenexpression wurde von einem -retroviralen Vektor (M87o)
Zusammenfassung
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gesteuert. Die genmodifizierten T-Zellen zeigten in vorangegangenen in vitro und in vivo
Experimenten, einen selektiven Vorteil gegenüber nicht modifizierten T-Zellen unter dem
Selektionsdruck einer aktiven HIV-1 Replikation und eine Absenkung des Gesamtvirusreplikation
in Form einer erniedrigten p24 Protein Viruslast. Im Ergebnis der klinischen Studie konnte
allerdings weder eine Absenkung der Plasmavirämie noch eine Akkumulation transgener T-Zellen,
trotz eines transienten CD4+ Anstiegs nach Zellreinfusion, beobachtet werden. Zusammenfassend
lässt sich an dieser Stelle festhalten, dass der Therapieansatz mit peripheren T-Zellen aus
vielschichtigen Gründen nicht erfolgreich war. In Kürze sind hier vor allem (i) die Limitation der
transduzierbaren Zielzellen des Virus (1x109; entsprechend nur 1% der Gesamtzielzellpopulation),
(ii) der stark Fortgeschrittene Krankheitsverlauf der 10 Patienten der Studie sowie (iii) ein
verminderter Selektionsdruck der Virusreplikation im Patienten im Vergleich zu den präklinischen
in vitro und in vivo Analysen.
Fortschritte auf dem Gebiet der stammzellbasierten Therapieansätze sowie Entwicklungen im
Bereich des Vektordesigns haben die verwendung von hematopoetischen stammzellen (HSCs) als
zielzellen einer HIV-Gentherapie ermöglicht. Hematopoetische Stammzellen (HSCs) sind auf
Grund ihrer Eigenschaft der Selbsterneuerung und der Differenzierung in alle Zellarten des
hematopoetischen Systems wichtige Zielzellpopulationen im Gentherapiesektor, da sie die
Möglichkeit einer lebenslangen Genkorrektur in allen hematopoetischen Zelltypen bieten. Nach 20
Jahren intensiver Vektorentwicklung, präklinischen Testungen sowie ersten klinischen Studien ist
die Gentherapie mit HSCs Realität geworden. Dabei konnte bereits in einigen Studien ein
klinischer Nutzen für die Patienten gezeigt werden. Die effizienteste Art des Gentransfers in HSCs
konnte bisher durch -retrovirale oder durch die neueren lentiviralen Vektoren erzielt werden. Die
Verwendung von lentiviralen Vektoren hat das Potential die in klinischen Studien aufgetretenen
Probleme der bisher verwendeten -retroviralen Vektoren zu überwinden; unter anderem
Insertionsmutagenese (oder Transaktivierung zellulärer Gene durch Integration der viralen
Genome in der Nähe von transkriptionellen Startregionen), niedriges Anwachsen transgener
Stammzellen sowie geringe Langzeit-Transgenexpressionslevel.
Lentivirale Vektoren der dritten Generation, wie sie auch in der vorliegenden Arbeit verwendet
wurden, besitzen die zusätzliche Sicherheitsmaßnahme, dass im viralen Genom die Enhancer-
Funktion in der 3‟-long terminal repeat Region (LTR) deletiert wurde. Diese Deletion wird im
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reversen Transkriptionsprozess auch auf die 5‟LTR übertragen, sodass die Transgenexpression
nicht mehr durch die LTR sondern von einem internen Promotor getreiben wird. Diese
Konfiguration der selbst-inaktivierenden (SIN) lentiviralen Vektoren besitzt eine vielfach
reduzierte Genotoxizität im Vergleich zu den LTR getriebenen -retroviralen Vektoren. Die
Eigenschaft der lentiviralen Vektoren auch ruhende Zellen effizient transduzieren zu können
ermöglicht eine stark verkürzte Kultivierungszeit der HSCs, welche wiederum eine verbesserte
Repopulierungskapazität der transgenen HSCs im Patienten zur Folge hat.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Testung von zwei Promotoren in Bezug auf die
Verwendbarkeit in klinischen Studien zur HIV Gentherapie. Für einen Vergleich der relativen
Promotoraktivität (pHR´) wurde zum einen der konstitutiv-aktive, zelluläre
Phosphoglyceratkinase-Promotor (PGK) und zum anderen der virale Myeloproliferative sarcoma
virus Promotor (MPSV) in das Vektorrückrad eines SIN lentiviralen Vektors kloniert, sodass die
jeweiligen Promotoren die Expression des antiviralen Transgens maC46 steuern. Für eine
optimierte RNA Prozessierung wurde eine künstliche Spleißakzeptordomäne in die 5‟ nichttranslatierte
Region (5‟-UTR) des Transgenkassette kloniert. Des Weiteren verfügten alle
verwendeten Vektoren über ein post-transkriptionelles regulatorisches Element (PRE) des
Woodchuck Hepatits Virus (Biber Hepatitis Virus) in der 3‟ nicht-translatierten Region der
Transgenkassette, um einen verbesserten Vektortiter zu erhalten. Sowohl die eingefügte
Spleißakzeptorsequenz als auch das wPRE erhöhten in den durchgeführten Experimenten die
allgemeinen Transgenexpressionslevel.
Die Expression von maC46 in der T-zelline PM-1 war unter der Kontrolle des MPSV Promotors
signifikant stärker im Vergleich zum PGK Promotor. Die jeweiligen Intron tragenden Varianten
der beiden Promotorkonstrukte erzielten höhere Transgenexpressionslevel als die Vektoren ohne
Intron.
Als nächstes wurden die verschiedenen Konstrukte in HIV Infektionsexperimenten getestet, ob sie
maC46 transduzierte Zelllinien effizient vor Infektion schützen können. Es zeigte sich, dass der
Fusionsinhibitor maC46 in HIV infizierten Mischkulturen transduzierter und nativer Zellen eine
starke positive Selektion transduzierter Zellen vermittelt.
Zusammenfassung
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Um die Tauglichkeit der neuen Vektoren für die Gentherapie weiter zu analysieren, wurden
humane primäre periphere Blutlymphozyten mit den beschriebenen Vektoren transduziert und in
Bezug auf Transgenexpressionstärke und Expressionsdauer untersucht. Die Expression eines
Transgens variiert generell auf Grund der verschiedenen Stadien der Zellaktivierung. Die
Expression von maC46 fluktuierte über den gesamten Beobachtungszeitraum je nach
Aktivierungsstatus der T-Zellen mit den höchsten maC46 Expression zu Beginn der Kultur
(entsprechend der T-Zellaktivierung, gemessen anhand der CD25+ Oberflächenexpressionslevel).
Die geringste Expression wurde 14 Tage nach Transduktion beobachtet; korrelierend mit einem
niedrigen Aktivierungsstatus der T-Zellen (niedrige CD25-Expression). Northern Blot Analysen
der Gesamt-RNA aus transduzierten Zellen an verschiedenen Zeitpunkten zeigten, dass die
maC46 Proteinabnahme mit einer geringeren mRNA Menge korreliert. Eine Restimulierung der TZellen
bewirkte eine Reaktivierung der maC46 Expression zu vergleichbaren Proteinlevels wie zu
Beginn des Experiments.
In Arbeiten anderer Gruppen konnte gezeigt werden, dass in den 3‟ Regionen der HIV-1 mRNAs
Zielsequenzen zellulärer Mikro-RNAs (miRNAs) lokalisiert sind, die nur in ruhenden aber nicht in
aktivierten CD4-T-Zellen exprimiert werden. Um eine miRNA induzierte Translationsinhibition
ausschließen zu können, wurde die miRNA-28 Zielsequenz im Kontext eines bidirektionellen
Promotors analysiert. Dabei wurden die Expressionslevel zweier Transgene (LNGFR und eGFP)
relativ zueinander verglichen. Beide Transgene wurden gleich stark im Zuge der Inaktivierung der
T-Zellen herunterreguliert, sodass ein Einfluss der miRNA-28 ausgeschlossen werden konnte.
Zusätzlich wurde eine Bisulfitsequenzanalyse auf den CpG Bereichen des MPSV-Promotors
durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der Promotor über den gesamten zeitlichen Verlauf
nur zu geringem Anteil methyliert wurde, sodass der Promotor prinzipiell transkriptionell aktiv in
humanen Lymphozyten ist.
Langzeitkulturen transduzierter PBLs zeigten eine Abnahme in der Transgenexpression, was
letztlich die Integrationsfähigkeit der verwendeten Vektoren oder die Fitness transduzierter Zellen
in Frage stellt. qPCR Analysen konnten zeigen, dass die Transgenexpressionabnahme nicht durch
einen Vektorkopienverlust hervorgerufen wurde. Eine vergleichende Analyse der
Lanzeitexpression von vier verschiedenen Vektoren mit zwei unterschiedlichen Transgenkassetten
(eGFP und maC46) und zwei unterschiedlichen Promotoren (SFFV und MPSV) ergab ebenfalls
Zusammenfassung
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eine stabile Vektorkopienzahl bzw. eine Abnahme der Transgenexpression in Abhängigkeit der TZellaktivierung.
In einem weiteren Schritt sollten die Beobachtungen aus den in vitro Experimenten in einem
Knochenmarkstransplantations-Mausmodel bestätigt werden. Hierfür wurden Knochenmarkszellen
einer immunkompetenten Maus entnommen und mit verschiedenen lentiviralen Konstrukten für
maC46 transduziert. Nach isogener Transplantation konnte gezeigt werden, dass maC46 in
verschiedenen lymphoiden Zelltypen, unter anderem Monozyten und CD4+ T-Zellen, in hohen
Konzentrationen exprimiert wurde. Es konnte kein signifikanter Unterschied in der maC46
Expression zwischen myleoiden und lymphoiden Zellen festgestellt werden. Gleichzeitig wurde
beobachtet, dass die Ausdifferenzierung der HSCs durch die maC46 Expression, auch bei hohen
Transgenkonzentrationen, nicht gestört wurde, sodass eine Stammzelltoxizität des maC46
wahrscheinlich nicht vorliegt.
Untersuchungen des peripheren Blutes HSC-transplantierter Tiere zeigten stabile Transgenlevel in
myeloiden Zellen und B-Zellen. In CD4+ T-Zellen wurde nach anfänglicher Verminderung der
Transgenmengen eine stabile Expressionsstärke von maC46 beobachtet, die über den
Beobachtungszeitraum von über 20 Wochen stabil war. Der Verlust der Expressionsstärke
korreliert mit dem Verlust an transgenen Zellen besonders im Zeitraum von 10 bis 14 Wochen.
Der beobachtete Verlust an maC46 Expression in CD4 T-Zellen unterstrich die Hypothese des
transkriptionellen Abschaltens in Abhängigkeit des T-Zellaktivierungsstatus. Eine detaillierte
Endanalyse der lymphatischen Organe zeigte eine hohes Maß an Chimerismus in sekundären
lymphatischen Organen (Lymphknoten, Milz und Knochenmark) sowie eine maC46 Positivität bis
zu 60% in CD4-T-Zellen. Gleichzeitig lag die DNA Vektorkopienzahl weit über den zu erwarteten
Kopien pro Zelle ausgehend von der maC46 Expressionsstärke; wiederum ein Anzeichen für
transkriptionelles Abschalten der maC46 Expression.
In einem weiteren Experiment wurden reife periphere T-Zellen mit maC46 kodierende lentivirale
Vektoren transduziert und in immundefiziente Mäuse transplantiert. Das Transplantat zeigte ein
verzögertes Angehen der Zellen, wobei nur nicht transduzierte Zellen nachzuweisen waren. Blut
und sekundäre lymphatische Organe zeigten ein geringes Maß an maC46 Kopien im Vergleich
zum Transplantat. Eine detaillierte Analyse von Tieren, die mit verschiedenen MOI (Multiplizität
der Infektion) transduzierten PBL injiziert wurden, zeigte keine signifikanten Unterschiede in der
Zusammenfassung
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maC46 Expression bzw. Kopienzahl in Blut, Milz und Lymphknoten. Hieraus kann eine mögliche
VSV-G Toxizität im Verlauf der Transduktion prinzipiell ausgeschlossen werden.
Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit subsumieren, dass eine
CD4 T-Zell-fokussierte Gentherapie dem grundlegenden Problem der Transgenexpression in
Abhängigkeit des Aktivierungsstatus der jeweiligen Zelle gegenübersteht. Da diese Abhängigkeit
der Transgene expression vom Aktivierungszustand der T-Zelle für T-Zellen, die in-vivo aus
transgenen HSCs differenziert sind, weniger aus geprägt zu sein scheint, sollten künftige klinische
studien zur HIV-Gentherapie mit stammzellen durchgeführt werden.
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Metadaten
Author:Shweta Pahujani
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-263936
Referee:Rolf Marschalek, Dorothee von Laer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/09/21
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2011/11/14
Release Date:2012/09/21
Pagenumber:131 S.
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
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$Rev: 11761 $