Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o

Non-clinical investigations of the gene therapy of the HIV infection with the retroviral vector M87o

Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontro
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
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With the introduction of the highly active anti-retroviral therapy (HAART) in 1995 the HIV infection converted from an acute life threatening diseased into an apparently well controlled chronicle disease. The virus is in
With the introduction of the highly active anti-retroviral therapy (HAART) in 1995 the HIV infection converted from an acute life threatening diseased into an apparently well controlled chronicle disease. The virus is in fact not completely eliminated for the body of the patient, thus the affected need to be treated lifelong. Long time medication is in many cases accompanied by serious side effects, leads to selection of resistant virus and therefore therapy has to be changed frequently. Gene therapeutic approaches that efficiently save the CD4-positive target cell population from the HIV infection by expression of anti-viral genes (intracellular immunization) could offer promising therapeutic alternatives. The retroviral vector M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) developed in the group of Prof. VON LAER at the Georg-Speyer-Haus in Frankfurt, Germany, expresses a membrane-anchored peptide, 46 amino acids long, that is able to inhibit gp41-mediated fusion of the virus and host cell membrane. It could be shown that M87o is able to inhibit the infection of T cell lines as well as primary lymphocytes by different HIV isolates. In the context of non-clinical investigations, it could be shown in vitro that transduction with M87o does not increase the risk of transformation and therefore does not increase the risk of neoplasia. It was demonstrated that M87o does not alter T cells with respect to phenotype and function. To support the investigation of the M87o gene therapy in a rhesus monkey model, a gene transfer protocol for peripheral monkey lymphocytes was developed able to achieve a gene transfer rate of approximately 50%. This protocol was consecutively applied in the context of a non-clinical study for investigation of toxicity and immunogenicity of the M87o gene therapy for production of two study transplants. Both cell products were transplanted without acute toxic reactions. M87o-positive T cells could be detected for up to 140 days by means of PCR. Immunological investigations did not give any hind on cellular of humoral immune reactions. M87o specific antibodies could not be detected in the serum of the animals. To support a clinical trial for investigation of toxicity and efficacy of the M87o gene therapy in HIV infected volunteers, a protocol for production of M87o-modified T cells (minimum requirement: 5x108 M87o-positive CD4 T cells per donor) was developed. Into this clinical trial, patients with a history of multiple therapy failure due to multi resistant HIV, a CD4 cell count of 50 to 200 cells per µl of blood, and a virus load greater than 5,000 per ml of blood were enrolled. First a transduction protocol that allowed genetic modification of at mean 46% of CD4 T cells was developed at experimental scale. During 10 days of culture cell number multiplier by 153 with complete inhibition of viral replication. The protocol was than successfully transferred from the experimental scale to the clinically relevant production scale. During three production campaigns a mean transduction rate of 29% was achieved and cells expanded 44-fold in number. At mean 91% cells of the total population were positive for CD3 as well as CD4. With the established protocol on average 2,3x109 CD3+/CD4+/M87o+ cells could be generated. HIV replication was completely inhibited in parallel. In the context of a clinical trial for investigation of toxicity and efficacy of the M87o gene therapy, ten study transplants were generated according to the protocol established during this work. All cell preparations were transplanted at the university hospital Eppendorf in Hamburg, Germany, and tolerated very well by the recipients.
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Metadaten
Author:Holger O. Martinius
URN:urn:nbn:de:hebis:30-48610
Referee:Annegret Strazinski-Powitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2007/09/11
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2007/05/04
Release Date:2007/09/11
Tag:Fusionsinhibitor ; M87o
HIV ; HIV infection ; M87o; fusion inhibitor ; gene therapy ; gp41 ; membrane fusion
SWD-Keyword:Gentherapie ; Glykoprotein GP 41 ; HIV ; HIV-Infektion ; Membranfusion
HeBIS PPN:190328770
Institutes:Biowissenschaften
Georg-Speyer-Haus
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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