Recombinant DNA-carrier proteins with improved intracellular trafficking capabilities for nonviral gene delivery

Safety concerns associated with the use of viral vectors in gene therapy applications have attracted considerable attention towards the development of nonviral vectors as alternatives for DNA delivery. While nonviral vec
Safety concerns associated with the use of viral vectors in gene therapy applications have attracted considerable attention towards the development of nonviral vectors as alternatives for DNA delivery. While nonviral vectors are commonly not associated with safety problems, they are still very inefficient compared to viral vectors, and require significant improvements to approach the efficiency of their viral counterparts. Meanwhile ligands or single-chain antibody fragments that bind to cell surface receptors for increased and/or specific cellular uptake, endosome escape activities, and nuclear localization sequences (NLSs) to enhance transport of plasmid DNA into the nucleus, have become available that can be incorporated into nonviral vectors to improve their efficacy. However, as gene delivery is a multistep process, the challenge is to incorporate multiple of these functional elements into a single nonviral vector system, while retaining their specific activities. A promising method to attach such entities to plasmid DNA is the use of multifunctional fusion proteins that bind to DNA through a DNA-binding domain. In principle, two types of DNA-binding domains/proteins can be used to anchor additional functional domains or peptides to a plasmid, namely sequence-specific DNA-binding domains, described in the first part of this thesis, or those that bind DNA independent of its sequence, exemplified in the second part of this work by a derivative of the human HMGB2 protein. The first fusion protein constructed and analyzed contained the E. coli LexA repressor as a sequence-specific DNA-binding domain. In addition, this DNA-carrier protein, termed TEL, included a bacterial translocation domain as an integrated endosome escape activity, and human TGF-a for specific targeting to the EGF-receptor (EGFR). TEL was expressed in E. coli and purified under both native and denaturing conditions. Purified, denatured TEL was refolded and subsequently shown to bind specifically to EGFR-expressing cells. However, inclusion of TEL in complexes of plasmid DNA and poly-L-lysine (pL) did not lead to increased gene delivery into EGFR-expressing COS-1 cells. Most likely this was due to the absence of DNA-binding activity of the LexA moiety in TEL. In contrast, native TEL was able to interact specifically with DNA. Nevertheless, since this interaction was rather weak, and refolding of denatured TEL had not resulted in functional activity of all of its protein domains, it seemed unlikely that fusion proteins containing LexA would exhibit gene transfer capabilities superior to those of similar DNA-carrier proteins previously constructed in our group. Further work therefore focused on the use of the E2C-Sp1C protein as an alternative sequencespecific DNA-binding domain. This artificial zinc-finger protein was fused to the single-chain antibody fragment scFv(FRP5), directed against the human ErbB2 growth factor receptor. The resulting 5-E2C fusion protein was expressed in E. coli and purified under native and denaturing conditions. Refolded and native 5-E2C were found to bind specifically to ErbB2-expressing cells, indicating that scFv(FRP5) in 5-E2C was functional in both preparations. In contrast, whereas refolded 5-E2C bound DNA only weakly, significant DNA binding was observed for native 5-E2C. In addition, it could not only be shown that the interaction of native 5-E2C with DNA containing its recognition sequence was specific, but also that this protein was able to bind DNA and recombinant ErbB2 simultaneously, demonstrating the functionality of both domains in native 5-E2C. Despite these encouraging results, the inclusion of native 5-E2C in pL- or polyethyleneimine (PEI)-DNA complexes did not lead to an (5-E2C-specific) enhancement of gene transfer efficiency, irrespective of the presence of the endosome-disruptive reagent chloroquine during transfection. In the second part of this thesis an alternative approach for the development of DNA-carrier proteins for nonviral gene delivery is described, based on human HMGB2, a DNA-binding protein without sequence specificity. HMGB2 contains an acidic C-terminus that has been found to decrease the affinity of the protein for DNA. Therefore, this C-terminal tail was deleted, resulting in an HMGB2-variant consisting of amino acids 1-186. HMGB2186, purified under native conditions from E. coli lysates, was able to interact with DNA and bound to the surface of different cell lines. Importantly, after binding to plasmid DNA HMGB2186 mediated gene delivery into COS-7 cells with higher efficiency than pL. In addition, HMGB2186-mediated gene transfer was strongly enhanced in the presence of chloroquine, indicating that the endocytic pathway was involved in cellular uptake. To improve internalization and intracellular routing of HMGB2186 as a DNA-carrier, a derivative containing the TAT47-57 cell-penetrating peptide (CPP), reported to facilitate cell entry independent of endocytosis, was constructed. Since this peptide also contains an NLS, in addition an HGMB2186-variant containing the SV40-NLS was constructed to investigate the effect of a peptide that has only nuclear localizing properties. Interestingly, the resulting TAT-HMGB2186 and SV40-HMGB2186 fusion proteins displayed DNA-binding activities similar to HMGB2186, but mediated gene delivery into different cell lines clearly more efficiently than the parental molecule. Furthermore, the efficacy of both fusion proteins was enhanced markedly in the presence of chloroquine, an indication that endocytosis was involved in the transfection process mediated by these proteins. This suggests that the increased transfection efficiency observed for TAT-HMGB2186 was more likely due to the NLS function present in the TAT47-57 peptide, rather than to its ‘cell penetrating properties’. Finally, the incorporation of functional peptides derived from human proteins into HMGB2186 was investigated. An uncharged CPP originating from Kaposi-FGF, reported to facilitate efficient cellular uptake of fused protein domains in an endocytosis-independent manner, was fused to HMGB2186 together with the SV40-NLS. Interestingly, the resulting KSV40-HMGB2186 fusion protein bound DNA similarly as previously tested DNA-carrier proteins, but did not mediate enhanced transfection compared to HMGB2186. In addition, the importin-b-binding (IBB) domain derived from human importin-a2 was investigated as a component of a DNA-carrier protein. Since the IBB domain can function as an NLS, it was fused to HMGB2186 resulting in the DNA-carrier protein IBBHMGB2186. Although IBB-HMGB2186 bound DNA in a similar manner as the other HMGB2186-derivatives, gene delivery mediated by IBB-HMGB2186 was only as effective as HMGB2186 mediated transfection, suggesting no significant role of the IBB domain. However, addition of chloroquine resulted in a remarkable enhancement of IBB-HMGB2186-mediated gene transfer, which was now more efficient than with any other HMGB2186-variant tested, and not much lower than gene transfer mediated by PEI, one of the most efficient transfection reagents available to date. To enhance nonviral gene delivery even further, the HMGB2186-based DNA-carrier proteins described in this thesis might now serve as building blocks for novel fusion proteins that include additional complementing activities. In this respect it seems particularly promising that, under conditions of effective end some escape, IBB-HMGB2186, which consists entirely of protein domains of human origin, was the most efficient of all proteins tested in this work.
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Dank ihrer hohen Gentransfereffizienz werden virale Vektoren am häufigsten als DNA-Träger für gentherapeutische Anwendungen verwendet. Diese Effizienz beruht auf der natürlichen Fähigkeit von Viren, Zellen zu infizieren 
Dank ihrer hohen Gentransfereffizienz werden virale Vektoren am häufigsten als DNA-Träger für gentherapeutische Anwendungen verwendet. Diese Effizienz beruht auf der natürlichen Fähigkeit von Viren, Zellen zu infizieren und dabei ihr genetisches Material in den Zellkern zu transportieren. Andererseits können virale Vektoren nur eine beschränkte Menge an genetischem Material transportieren und rufen erhebliche Sicherheitsbedenken hervor. Virale Vektoren könnten zum Beispiel Insertionsmutagenese verursachen oder eine starke Immunantwort induzieren. Dies hat dazu geführt, daß der Entwicklung nicht-viraler Vektoren als alternative Gentransfersysteme immer mehr Bedeutung zugemessen wird. Weil nicht-virale Vektoren gewöhnlich nicht in das Genom der Zielzelle integrieren und keine spezifische Immunantwort erzeugen, sollten sie in der Lage sein, die Sicherheitsbedenken gegenüber viralen Vektoren zu umgehen. Zusätzlich sind synthetische Gentransfersysteme im Gegensatz zu viralen Vektoren nicht in der Größe des zu transportierenden Gens limitiert, und haben Vorteile im Bereich der einfachen Anwendung, der Produktion und der Flexibilität des Designs. Leider sind nicht-virale Vektoren immer noch ineffizient im Vergleich mit viralen Vektoren, was ihre breite Anwendung in der Gentherapie bisher verhindert hat. Deswegen ist es notwendig, nicht-virale Vektoren noch erheblich zu verbessern, damit sie die Effizienz von viralen Vektoren in der Überwindung biologischer Barrieren des Gentransfers erreichen. Eukaryotische Zellen weisen eine Reihe von Barrieren auf, die von nicht-viralen Vektoren überwunden werden müssen, damit ihre genetische Fracht den Zellkern der Zielzelle erreichen kann. Die Zellmembran stellt die erste dieser Barrieren dar. Im allgemeinen kann sie aber von den meisten nicht-viralen Vektoren durch Bindung an Zelloberflächenmoleküle überwunden werden. Die Internalisierung erfolgt dann durch Endozytose. Nach Aufnahme in die Zelle befinden sich die DNA-Vektor-Komplexe in endosomalen Vesikeln und werden zu Lysosomen transportiert, in denen die DNA degradiert wird, wenn sie nicht vorher das Zytoplasma erreicht. Aus diesem Grund werden Endosomen als eine weitere wichtige Barriere angesehen. Wenn die DNA-Vektor Komplexe das Zytoplasma erreicht haben, stellt der Transport in den Zellkern den letzten Schritt des nicht-viralen Gentransferprozesses dar. In Abwesenheit von Trägermolekülen verhindert die negative Ladung der DNA die passive Diffusion der Nukleinsäure über die Zellmembran. Deswegen wird im allgemeinen eine kationische Komponente, die in der Lage ist, die DNA in kleine Partikel zu verpacken und ihre Ladung zu neutralisieren, als minimale Voraussetzung für nicht-virale Vektoren betrachtet. Desweiteren hat die Identifizierung der verschiedenen zellulären Barrieren, die den nicht-viralen Gentransfer behindern, zur Entwicklung mehrerer funktionaler Werkzeuge geführt, die so konstruiert wurden, daß sie spezifisch einzelne dieser Barrieren überwinden können. Beispiele solcher Werkzeuge sind Liganden oder single-chain Antikörperfragmente, die zur verstärkten und/oder spezifischen Aufnahme in Zellen an Zelloberflächenrezeptoren binden, sowie endosomolytische Aktivitäten und nukleäre Lokalisationssequenzen (NLS) zum verbesserten Transport der Plasmid DNA in den Zellkern. Allerdings sollte effizienter Gentransfer als ein Mehrstufenprozess betrachtet werden, wobei der Transport genetischen Materials über alle diese Barrieren notwendig ist. Die Herausforderung liegt deswegen vor allem darin, nicht-virale Vektoren zu entwickeln, die mehrere dieser funktionalen Werkzeuge enthalten und dabei ihre spezifische Wirkung nicht verlieren. Eine vielversprechende Methode, um solch funktionale Werkzeuge an Plasmid DNA zu koppeln, ist die Verwendung rekombinanter Proteine, die mittels DNA-Bindungsdomänen mit der Plasmid DNA interagieren können. Rekombinante Fusionsproteine haben den Vorteil, daß sie relativ einfach modifiziert werden können und dadurch mehrere verschiedene funktionale Domänen enthalten können. Desweiteren binden solche Fusionsproteine nicht kovalent an DNA, was Schäden an der Expressionskassette verhindert, wie sie bei chemischen Kopplungstechniken vorkommen. Prinzipiell gibt es zwei verschiedene Arten von DNA-Bindedomänen oder Proteinen, die verwendet werden könnten, um weitere funktionale Proteindomänen oder Peptide mit Plasmid DNA zu verknüpfen. Dies sind sequenzspezifische DNA-Bindungsdomänen, wie sie zum Beispiel in vielen Transkriptionsfaktoren vorkommen, oder solche Domänen, die DNA unabhängig von der Sequenz binden, wie zum Beispiel Histone oder Mitglieder der high mobility group (HMG) Familie. Obwohl sequenzspezifische DNA-Bindungsdomänen den Vorteil haben, daß sie die Bildung von stöchiometrisch definierten Protein-DNA Komplexen ermöglichen, sind sie selber nicht in der Lage die DNA in kleine Partikel zu verpacken und erfordern deswegen den zusätzlichen Gebrauch von DNA kondensierenden Reagenzien, um effizienten Gentransfer zu ermöglichen. Im Gegensatz hierzu könnten DNA-Bindungsdomänen, die DNA unabhängig von der Sequenz binden, Plasmid DNA selbst kondensieren und wären so in der Lage Gentransfer ohne Zugabe von weiteren Komponenten zu vermitteln. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung rekombinanter DNA-Trägerproteine beschrieben, die sequenzspezifische DNA-Bindungsdomänen enthalten, während sich die Arbeit im zweiten Teil auf die Anwendung einer Variante des humanen HMGB2 Proteins konzentriert, das DNA auf eine nicht-sequenzspezifische Weise bindet. Das erste Fusionsprotein, das entwickelt wurde, enthält das E. coli LexA repressor Protein als sequenzspezifische DNA-Bindungsdomäne. Desweiteren enthält dieses DNA-Trägerprotein, genannt TEL, die Translokationsdomäne aus Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (ETA) für die Freisetzung aus endosomalen Vesikeln, und humanes TGF-a für die spezifische Bindung an den EGF-Rezeptor (EGFR). Dieser Rezeptor wird in einer Vielzahl humaner Tumoren überexprimiert. Das TEL Protein wurde in E. coli exprimiert und sowohl unter nativen als auch unter denaturierenden Bedingungen gereinigt. Denaturiertes und gereinigtes TEL wurde zurückgefaltet. Mittels Durchflußzytometrie konnte gezeigt werden, daß dieses Protein in der Lage war, spezifisch an EGFR-exprimierende Zellen zu binden. Obwohl dieses Ergebnis vielversprechend war, stellte sich heraus, daß TEL-enthaltende Poly-L-lysin (pL)-DNA Komplexe keinen verbesserten Gentransfer im Vergleich zu pL-DNA-Komplexen ohne TEL ermöglichen. Wahrscheinlich wurde dies von einem Defekt in der DNABindung durch die LexA Domäne in rückgefaltetem TEL verursacht, da die Interaktion des Fusionsproteins mit einem doppelsträngigen Oligonukleotid, das die LexA Konsensusbindesequenz enthielt, in einem Gelretardationsexperiment nicht nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz hierzu war nativ gereinigtes TEL in der Lage, spezifisch an dieses DNA Fragment zu binden. Dies zeigte, daß es prinzipiell möglich ist, ein DNA-Trägerprotein zu produzieren, das funktional aktives LexA enthält. Die Tatsache, daß diese Interaktion ziemlich schwach war, und das Problem, daß die Rückfaltungsprozedur nicht in funktionaler Aktivität aller Proteindomänen in TEL resultierte, ließen es als fragwürdig erscheinen, ob LexA enthaltende Fusionsproteine grundsätzlich bessere Gentransferkapazitäten erreichen würden als ähnliche, auf Gal4-basierende DNA-Trägerproteine, die in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe beschrieben wurden. Deswegen konzentrierten sich die weiteren Arbeiten dieses Abschnitts auf den Einsatz einer alternativen sequenzspezifischen DNA-Bindungsdomäne. Als vielversprechende Alternative zu LexA wurde eine artifizielle DNA-Bindungsdomäne verwendet, die von Beerli et al. entwickelt wurde, um eine vorher definierte Sequenz zu erkennen. Dieses mit E2C-Sp1C bezeichnete Protein wurde mit dem single-chain Antikörperfragment scFv(FRP5) fusioniert, das spezifisch an humanes ErbB2 bindet, ein weiteres Mitglied der EGFR-Familie der Rezeptortyrosinkinasen, das häufig überexprimiert auf humanen Tumorzellen gefunden wird. Das resultierende Molekül, bezeichnet mit 5-E2C, enthält keine bakterielle Translokationsdomäne, um so den Bauplan zu vereinfachen und die Expression und spätere Rückfaltung zu verbessern. 5-E2C wurde ebenfalls in E. coli exprimiert und unter nativen und denaturierenden Bedingungen gereinigt. Denaturiertes 5-E2C wurde rückgefaltet und zusammen mit nativem 5-E2C in einem FACS Experiment auf ErbB2-Bindung untersucht. Es zeigte sich, daß sowohl natives als auch rückgefaltetes 5-E2C in der Lage waren, spezifisch an ErbB2-exprimierende Zellen zu binden, was ein starkes Indiz für die Funktionalität der scFv(FRP5) Domäne war. Im Gegensatz dazu konnte signifikante DNA-Bindung nur für natives 5-E2C nachgewiesen werden, während rückgefaltetes 5-E2C in einem Gelretardationsexperiment nur schwach mit DNA interagierte. Aus diesem Grund wurden weitere Experimente nur mit nativem 5-E2C durchgeführt. In einem nachfolgenden Gelretardationsexperiment konnte nicht nur die Spezifität der Interaktion von nativem 5-E2C mit einem DNA Fragment, das die E2C Erkennungssequenz enthielt, gezeigt werden, sondern auch gleichzeitige Bindung an lösliches rekombinantes ErbB2. Der Nachweis dieses trimeren Komplexes von 5-E2C, DNA, und ErbB2 war ein Beweis für die Funktionalität beider Domänen in 5-E2C und bestätigte indirekt auch die spezifische Bindung von 5-E2C an ErbB2-exprimierende Zellen, wie sie im FACS Experiment festgestellt wurde. Trotz dieser Ergebnisse resultierte die Anwesenheit von nativem 5-E2C in pL- oder Polyethylenimin-DNA Komplexen unerwarteterweise nicht in erhöhtem Gentransfer in ErbB2-exprimierende Zellen. Desweiteren bewirkte auch die Zugabe des endosomolytischen Reagenz Chloroquin keine 5-E2C vermittelte Steigerung der Gentransfereffizienz. Die Gründe für diese negativen Ergebnisse sind bisher unklar, jedoch könnte die relativ geringe Menge an nativem 5-E2C, die in den Experimenten eingesetzt wurde, mitverantwortlich sein für die fehlende Verbesserung der Transfektion. Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse des ersten Teils dieser Arbeit, daß die LexA und E2CSp1C enthaltenden DNA-Trägerproteine TEL und 5-E2C nicht in der Lage waren die durch kationischen Polymeren vermittelte Transfektion zu verbessern. Obwohl die genauen Gründe hierfür nicht geklärt werden konnten, deuten die schlechten DNA-Bindungseigenschaften beider TEL-Präparationen und auch die von rückgefaltetem 5-E2C darauf hin, daß LexA und E2C-Sp1C enthaltende Fusionsproteine in funktionell aktiver Form nur schwierig herzustellen sind. Während die Zahl der individuelle Fusionsproteine mit sequenzspezifischen DNA-Bindungsdomänen, wie LexA und E2C-Sp1C, die an ein Molekül Plasmid DNA gebunden sind nicht nur von der vorhandenen Menge an funktionellem Protein abhängt, sondern ebenso von der Anzahl der spezifischen Erkennungssequenzen in der Plasmid DNA, sind Proteine, die DNA unabhängig von der Sequenz binden, nicht auf diese Weise limitiert, und könnten selbst in der Lage sein DNA in kleine Partikel zu verpacken. Deswegen wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein alternativer Lösungsweg versucht, der auf sequenzunspezifischen DNA-Trägerproteinen basiert. Als ein Protein mit derartigen DNA-Bindungseigenschaften wurde das menschliche Chromatin-assoziierte Protein HMGB2 verwendet. HMGB2 besitzt einen sauren C-Terminus, von dem bekannt ist, daß er die Affinität des Proteins für DNA verringert. Aus diesem Grund wurde dieser C-terminale Bereich entfernt, was eine HMGB2-Variante entstehen ließ, die aus den Aminosäuren 1-186 besteht. Im Gegensatz zu den DNA-Trägerproteinen TEL und 5-E2C konnte dieses Molekül, genannt HMGB2186, in nativem Zustand und in großen Mengen in E. coli produziert werden. Die Analyse der DNABindungseigenschaften zeigte, daß nativ gereinigtes HMGB2186 in der Lage war die Migration von Plasmid DNA in der Agarosegelelektrophorese komplett zu unterbinden, was die Bildung ladungsneutraler Partikel anzeigt. Zusammen mit dem Befund, daß HMGB2186 an die Oberfläche von verschiedenen Zellinien bindet, war dies ein Indiz dafür, daß HMGB2186 erfolgreich als nicht-viraler Vektor eingesetzt werden könnte. In anschließenden Transfektionsexperimenten konnte in der Tat gezeigt werden, daß HMGB2186 in der Lage ist, Gentransfer in COS-7 Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise und effizienter als Poly-L-Lysin zu vermitteln. Desweiteren konnte die Transfektionseffiezienz von HMGB2186-DNA Komplexen in der Gegenwart von Chloroquin stark gesteigert werden, ein Indiz für die Beteiligung endozytotischer Mechanismen während der Aufnahme der Protein-DNA Komplexe in Zellen. Diese Ergebnisse deuteten an, daß HMGB2186 möglicherweise als Basismolekül für den Einbau weiterer funktioneller Peptide oder Proteindomänen dienen könnte, mit dem Ziel, die Aufnahme in die Zelle und den intrazellulären Transport von Plasmid DNA weiter zu verbessern. Um Internalisierung durch Endozytose zu umgehen und direkten Zugang zum Zytoplasma zu gewähren, wurde das TAT47-57 zellpenetrierende Peptid (cell penetrating peptide, CPP) an den N-Terminus von HMGB2186 fusioniert. Dieses Peptid enthält zudem eine nukleäre Lokalisationssequenz (NLS). Daher wurde ein weiteres DNA-Trägerprotein konstruiert, das die klassische NLS des SV40 large T-antigen (SV40-NLS) enthält, um so den Effekt eines Peptides, das ausschließlich NLS Eigenschaften besitzt, zu untersuchen. Die resultierenden Fusionsproteine TAT-HMGB2186 und SV40-HMGB2186 konnten in großen Mengen exprimiert und gereinigt werden. In Agarose-Gelretardationsexperimenten waren diese Proteine in der Lage, mit vergleichbarer Effizienz wie das parentale HMGB2186 Protein, Plasmid DNA zu retardieren. Allerdings vermittelten beide Fusionsproteine deutlich effizienteren Gentransfer in unterschiedlichen Zelllinien im Vergleich zu HMGB2186, ein Zeichen dafür, daß der Einbau dieser Peptide sich auf die Transfektionseigenschaften der resultierenden Moleküle positiv ausgewirkt hat. Desweiteren konnte die Effektivität beider Fusionsproteine durch die Zugabe von Chloroquin deutlich gesteigert werden. Da bekannt ist, daß Chloroquin mit den endozytotischen Internalisierungswegen der Zelle interferiert, war dies ein klares Indiz dafür, daß ein endozytotischer Mechanismus in dem von TAT-HMGB2186 und SV40-HMGB2186 vermittelten Transfektionsprozess involviert ist. Für TAT-HMGB2186 war dieses Ergebnis überraschend, da veröffentlicht war, daß das TAT47-57 Peptid durch einen Endozytose unabhängigen Mechanismus die Aufnahme in Zellen bewirkt, wobei sogar eine direkte Translokation durch die Zellmembran involviert sein sollte. Der Befund, daß SV40-HMGB2186, das nur ein NLS-Peptid enthält, mit ähnlicher Effizienz Gentransfer vermitteln konnte wie TAT-HMGB2186, spricht ebenfalls gegen einen Mechanismus, bei dem direkte Membrantranslokation involviert ist, und deutet stattdessen auf eine Rolle der NLS in dem TAT47-57 Peptid hin. Obwohl die TAT47-57 und SV40-NLS Peptide HMGB2186-vermittelte Transfektion klar verbessern konnten, sind sie viralen Ursprungs und könnten im Falle einer in vivo Applikation unerwünschte Immunantworten hervorrufen. Deswegen wurde auch die Fusion von funktionellen Peptiden, abgeleitet von menschlichen Proteinen, an DNA-Trägerproteine basierend auf HMGB2186 untersucht. So war veröffentlicht, daß ein CPP, abgeleitet von Kaposi-FGF (K-FGF oder FGF-4), Endozytose-unabhängig eine effiziente Aufnahme von fusionierten Proteindomänen in Zellen vermitteln sollte. Allerdings enthält dieses ungeladene Peptid keine NLS und wurde deswegen zusammen mit dem gut charakterisierten SV40-NLS an HMGB2186 fusioniert. Interessanterweise zeigte das resultierende KSV40-HMGB2186 Fusionsprotein ähnliche DNA-Bindungseigenschaften wie die zuvor getesteten DNA-Trägerproteine, war aber nicht in der Lage, im Vergleich zu HMGB2186 verbesserten Gentransfer zu vermitteln. Die Ursache hierfür könnte darin liegen, daß das K-FGF Peptid im Gegensatz zu früheren Berichten nicht in der Lage ist, die Aufnahme in Zellen zu verbessern, wie kürzlich von einer anderen Gruppe berichtet wurde. Zuletzt wurde die von humanem Importin-a2 abgeleitete Importin-b-Bindedomäne (IBB) als eine Alternative zur SV40-NLS untersucht. Die IBB-Domäne repräsentiert die minimale strukturelle Region von Importin-a, die notwendig ist, um Importin-b mit hoher Affinität zu binden, und ist deswegen essentiell für den nukleären Transport von Proteinen, die klassische NLS Sequenzen enthalten. Da die IBB-Domäne selbst als NLS funktionieren kann, wurde sie an HMGB2186 fusioniert, wodurch das DNA-Trägerprotein IBB-HMGB2186 entstand, welches komplett aus Proteindomänen menschlichen Ursprungs besteht. Obwohl gereinigtes IBB-HMGB2186 vergleichbare DNA-Bindungseigenschaften zeigte wie andere HMGB2186-Derivate, war IBB-HMGB2186-vermittelter Gentransfer nur so effizient wie Transfektion vermittelt von HMGB2186. Dies deutete an, daß die IBB-Domäne hierbei keine signifikante Rolle spielte. Die Zugabe von Chloroquin hatte allerdings eine bemerkenswerte Steigerung IBB-HMGB2186-vermittelten Gentransfers zur Folge. Hierbei war die Transfektionseffizienz deutlich höher als die von allen anderen getesteten HMGB2186-Varianten, und nur wenig niedriger als Gentransfer vermittelt von Polyethylenimin, einem der effizientesten Transfektionsreagentien, die momentan erhältlich sind. Da IBB-HMGB2186-vermittelte Transfektion erheblich stärker von der Freisetzung aus endosomalen Vesikeln abhing, als es bei den TATHMGB2186 und SV40-HMGB2186 DNA-Trägerproteinen, die auch NLS-Peptide enthalten, der Fall war, deuten diese Ergebnisse darauf hin, daß die IBB-Domäne in IBB-HMGB2186 nur eine NLS-Funktion hat, während die TAT47-57 und SV40-NLS Peptide noch weitere Funktionen im Gentransferprozess haben könnten, wie zum Beispiel die Verbesserung der DNA Kondensierung oder zellulären Aufnahme. Obwohl die Funktionalität mancher ihrer individuellen Domänen klar gezeigt werden konnte, waren die DNA-Trägerproteine TEL und 5-E2C, die die sequenzspezifischen DNA-Bindungsdomänen LexA und E2C-Sp1C enthalten, nicht in der Lage, von kationischen Polymeren vermittelten Gentransfer zu steigern. Im Gegensatz dazu vermittelte ein DNA-Trägerprotein basierend auf dem humanen HMGB2 Protein, das dafür bekannt ist, DNA unabhängig von der Nukleotidsequenz zu binden, effizienten Gentransfer ohne Zugabe weiterer Reagenzien. Wichtig ist, daß Varianten dieses HMGB2186 Moleküls, die zusätzliche funktionelle Peptide enthalten, wie zum Beispiel das TAT47-57 Peptid oder nukleäre Lokalisierungssequenzen wie die SV40-NLS und die IBB-Domäne, die Transfektionseffizienz erheblich steigern konnten, vor allem in Gegenwart des endosomolytischen Reagenz Chloroquin. Die in dieser Arbeit beschriebenen, auf HMGB2186 basierenden DNATrägerproteine, könnten daher als Ausgangspunkt für weiter optimierte Fusionsproteine dienen, die zusätzliche funktionelle Peptide enthalten. In dieser Hinsicht erscheint es vielversprechend, daß sich das komplett aus Proteindomänen humanen Ursprungs bestehende IBB-HMGB2186, unter Bedingungen effektiver Freisetzung aus dem Endosom, als das effizienteste von allen in dieser Arbeit untersuchten DNA-Trägerproteinen erwies.
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Author:Arjen Sloots
Referee:Robert Tampé
Document Type:Doctoral Thesis
Date of Publication (online):2007/08/23
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2004/12/09
Release Date:2007/08/23
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS PPN:316269840
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

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