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TIP47 plays a crucial role in HCV morphogenesis and release by its interaction with viral nonstructural protein 5A and host protein Rab9 (2012)

Daniela Ploen

Hepatitis C virus (HCV) assembly and production is closely linked to lipid metabolism. Indeed, lipid droplets (LD) have been shown to serve as a platform for HCV assembly. To investigate the effect of HCV on the host cell proteome, 2D-gelelectrophoresis with subsequent MALDI-TOF mass spectrometry of HCV replicating and the corresponding control cells were done. Based on this analysis, it was found out that HCV-replicating Huh7.5 cells revealed lower amounts of TIP47 (tail interacting protein of 47kD) compared to HCV-negative cells. TIP47, a cytoplasmic sorting factor, has been shown to be associated with lipid droplets. As it is known that HCV-replication and assembly takes place at the so called ”membranous web” that is composed of LDs and rearranged ER-derived membranes, it was tempting to investigate the role of TIP47 in HCV life-cycle. Western blot analysis did reveal that overexpression of TIP47 in HCV replicating Huh7.5 cells leads to decreased amounts of the HCV core protein while the levels of non-structural protein (NS)5A and intracellular HCVgenomes are increased. Moreover, in TIP47 overproducing cells higher amounts of infectious HCV particles are secreted. Vice versa, inhibition of TIP47 expression by siRNA results in a decreased level of intracellular NS5A, increased amounts of intracellular core and less infectious viral particles in the supernatant. In addition, complete silencing of TIP47 by lentiviral transduction abolishes HCV replication that can be restored by transfection of these cells with a TIP47 expression construct. It has been shown recently that apoE binds to NS5A and that this interaction plays an important role for the HCV life cycle (Benga et al., 2010). The C-terminal part of TIP47 harbours a 4 helix bundle motif and displays high homology to the N-terminus of apoE. Therefore, we investigated the interaction of NS5A and TIP47. Confocal double immunofluorescence microscopy revealed that a fraction of NS5A colocalizes with TIP47. Coimmunoprecipitation experiments and a yeast-two-hybrid screening confirmed the interaction between NS5A and TIP47 and deletion of the N-terminal-TIP47-PAT domain abolishes this interaction. From this we conclude that the TIP47-NS5A interaction is required for virus morphogenesis. Moreover, TIP47 can bind to Rab9 and this is relevant for targeting the viral particle out of the cell. In accordance to this, TIP47 was identified to be associated to the viral particle. Mutants of TIP47 that fail to bind Rab9 reveal lower amounts and a changed distribution of the HCV core protein. Furthermore, we could see that the core staining colocalizes with subcellular structures that were identified as autophagosomes using a p62-specific antibody which is a specific autophagosome-marker. Based on this, we hypothized that destruction of the Rab9 binding domain misdirects the viral particle towards the lysosomal compartment. For the first time it could be shown that TIP47 interacts with NS5A and is associated to the viral particle, therefore plays a crucial role for the virus morphogenesis and secretion of the viral article. Taken together, these results indicate that TIP47 is an essential cellular factor for the life cycle of HCV Abstract and might be used as target for antiviral treatment, e.g. by targeting the NS5A-TIP47 interaction, based on small molecules that mimic the NS5A-specific sequence that binds to TIP47 which might result in a competition of the TIP47/NS5A interaction.

Cannabinoid-mediierte Neuroprotektion in exzitotoxisch geschädigten organotypischen hippokampalen Schnittkulturen (OHSC) der Ratte mit besonderem Fokus auf N-Arachidonyl-Dopamin (NADA) (2012)

Urszula Grabiec

Schädigungen des Zentralnervensystems führen häufig zu schweren irreversiblen Schäden, die die Betroffenen vor große körperlichen und psychischen Herausforderungen stellen. Auf zellulärer Ebene ist bekannt, dass das Gehirn über protektive Mechanismen verfügt, die zwar nach der Schädigung aktiviert werden deren Potential jedoch nicht ausreicht, um den Schaden einzudämmen. Das Endocannabinoidsystem wurde mehrfach als ein solches protektives System bei ZNS Läsionen beschrieben. Zu den klassischen und gut untersuchten Endocannabinoiden (eCBs) wie Anandamid oder 2-AG kommen im Gehirn mehrere eCBs vor, deren physiologische und pathologische Bedeutung schwer einzuordnen ist. Das N-Arachidonyl-Dopamin (NADA) gehört zu dieser Gruppe und wirkt über bereits bekannte Cannabinoid Rezeptoren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Wirkung von NADA auf das Überleben der Körnerzellen im Gyrus dentatus im Modell der organotypischen hippokampalen Schnittkulturen (OHSC) untersucht. Weiterhin wurden die beteiligten Rezeptoren und die intrazellulären Signalkaskaden an neuronalen und gliösen Primärkulturen sowie Zelllinien analysiert. Nach der NMDA Schädigung kam es zum massiven Absterben der Neurone und einer deutlichen Zunahme der Zahl von Mikrogliazellen. NADA (100 pM-10 μM) hemmte den Prozess der neuronalen Schädigung und führte bei 1 nM und 1 μM zum Rückgang der Mikrogliaanzahl in geschädigten OHSC. Weiterführende Analysen ergaben, dass NADA Effekte über den Cannabinoid (CB)1 Rezeptor mediiert. Sowohl die abnCBD, CB2, TRPV1 und TRPA1 Rezeptoren als auch -als struktureller Bestandteil des NADA waren an den Wirkungen nicht beteiligt. Es ist bekannt, dass der TRPV1 Rezeptor eine große Rolle bei NADA mediierten Effekten in der Peripherie spielt. Das Vorkommen bzw. die funktionelle Aktivität des TRPV1 im ZNS ist Gegenstand kontroverser Diskussionen. TRPV1 konnte auf mRNA Ebene in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen (OHSC), Astrozyten, hippokampalen Neuronen und DRG (Spinalganglien) nachgewiesen werden. Mittels Calcium Imaging und Elektrophysiologie konnte an HEK293-TRPV1 Zellen NADA als Agonist des TRPV1 bestätigt werden. In allen untersuchten Zellen war jedoch die Funktionstüchtigkeit des TRPV1 Rezeptors mittels Calcium Imaging Messungen nicht nachweibar. Im nächsten Schritt wurde geprüft, welche der klassischen mit dem Endocannabinoidsystem assoziierten Signalkaskaden an der NADA vermittelten Protektion teilnehmen. Die Signalkaskaden p38 und p44/42 MAPK wurden in den stimulierten und nichtstimulierten Zellen durch NADA nicht beeinflusst. NADA gehört somit zur Gruppe der neuroprotektiv wirkenden Endocannabinoide, welches seine Effekte über den CB1 Rezeptor vermittelt. Im Schädigungsmodell des OHSC spielt der TRPV1 Rezeptor keine Rolle. Weitere intrazelluläre Signalkaskaden, wie der PLC Weg, bedürfen einer weitergehenden Analyse bezüglich ihrer Involvierung in NADA-vermittelte Effekte.

The role of the Ca2+-dependent protease calpain in the diabetes-associated platelet hyperreactivity (2012)

Johann Isaak

Platelets from diabetic patients are characterised by hyperreactivity resulting in exaggerated adhesion, aggregation and thrombus formation which contribute to the development of cardiovascular complications known to be one of the main causes of diabetes-related mortality. One of the mechanisms suggested to be involved in the diabetes-related platelet hyperactivation is the increased [Ca2+]i which leads to the overactivation of Ca2+-dependent proteases, the calpains. Among the calpain isoforms expressed in platelets the two ubquitiously expressed μ- and m-calpain are thought to play an important role in physiological and pathophysiological processes. Particularly μ-calpain is known to be involved in many steps of physiological platelet activation such as aggregation, adhesion, secretion, and signalling. However, we could show that diabetes was associated with an enhanced activation of both μ- and m-calpain in platelets In the first part of the study we focussed on the characterization of the molecular mechanism regulating calpain activity. Indeed, although Ca2+ is considered to be the main regulator of the proteolytic activity of the conventional calpains, other mechanisms such as the presence of phospholipids and phosphorylation have been reported to affect their activity. Since most studies reported the phosphorylation of m-calpain we were interested to see whether μ-calpain activity might be also affected by phosphorylation. We could show that the activity of μ-calpain was enhanced by the PKC activator PMA suggesting its possible regulation by phosphorylation. However, whether PKC directly targeted μ-calpain remains unclear. Given that substrate recognition is important for a protease to process its substrate and since no common consensus could be attributed to calpain substrates, our next interest was to understand the mechanism regulating the recognition of its substrates by calpain. Since phosphorylation has been reported to protect different proteins from calpain degradation we investigated whether the calpain substrate CD31 could be phosphorylated in platelets and whether this could affect its recognition by calpain. Although we could show that the tyrosine phosphorylation of CD31 was increased after activation of platelets by thrombin and that this effect was attenuated in platelets from diabetic patients, tyrosine phosphorylation of CD31 seemed to have no effect on its sensitivity to calpain-mediated proteolysis. After the analysis of the mechanism regulating calpain activity as well as its interaction with its substrates, our next interest was the identification of new calpain substrates in platelets. Since a previous study from our group showed that PPARγ agonists could indirectly reverse the diabetes-associated calpain activation we performed DIGE analysis of platelet samples from diabetic patients before and after PPARγ agonist treatment. Using this approach we could identify four novel calpain substrates in platelets: Integrin-linked kinase (ILK), α parvin, CLP36 and septin-5. Next, we assessed the effect of calpain-mediated cleavage on the function of these newly identified proteins. We could show that μ-calpain was essential for the dissociation of ILK from the IPP complex and its activation while m-calpain-mediated cleavage led to its cleavage and inactivation. Functionally, we also showed that μ-calpain was involved in platelet adhesion while m-calpain was important for spreading. The next protein we analysed was septin-5, a small GTPase known to regulate platelet degranulation by association with other septins and syntaxin-4. We found that the interaction between septin-5 and syntaxin-4 was inhibitory for platelet degranulation. We could demonstrate that the μ-calpain-mediated cleavage dissociated septin-5 from syntaxin 4 and led to increased secretion of platelet α-granules. Next, we investigated the in vivo role of calpain in the diabetes-associated platelet hyperreactivity. We induced diabetes in mice and could reproduce calpain activation in platelets such as that found in human. Indeed, calpain activation in murine platelets also led to the cleavage of several calpain substrates including ILK and septin-5. Moreover, platelets from diabetic mice demonstrated an increased aggregation and thrombus formation in vivo. Treatment of the animals with the calpain inhibitor A-705253 (30 mg/kg/day for 10 days) significantly restored platelet function and substrate cleavage. In conclusion, in this part of the study, we could show that the increased calpain-dependent α-granule secretion and platelet adhesion may account for the enhanced vascular proliferation and thrombus formation in diabetes and calpain inhibition represents a promising way to prevent atherothrombosis development. In the last part of the study we analysed another enzyme known to play a crucial role in diabetes, the AMPK which is an energy-sensing kinase known to be impaired in diabetes. We could show that the two catalytic subunits AMPK α1 and α2 are expressed in platelets. The AMPKα2 seemed to be the subunit involved in platelet activation since AMPKα2-deficient mice demonstrated a defect in clot retraction and the stabilization of the thrombus while the animals showed a normal bleeding time. Mechanistically, we showed in platelets that the upstream kinase of AMPKα2 is LKB1 which was activated by thrombin stimulation via a PI-3K-dependent pathway. AMPKα2 then phosphorylated the Src-family kinase Fyn, which is responsible for the phosphorylation of its substrate β3 integrin on Tyr747. These data indicate that AMPKα2, by affecting Fyn phosphorylation and activity, plays a key role in platelet αIIbβ3 integrin signalling, leading to clot retraction and thrombus stability. Although the effect of diabetes in the AMPK-dependent pathway could not be investigated we assume that the dysregulation of this pathway may account for the thrombus destabilization and enhanced embolization encountered in diabetes.

Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren der 5-Lipoxygenase mit Thiazol-Grundgerüst (2012)

Sebastian Barzen

In der Arbeit werden Inhibitoren der 5-Lipoxygenase mit Thiazol-Grundgerüst beschrieben.

Allergenes Potenzial und Epitopstruktur von beta-Conglycinin aus der Sojabohne (2011)

Yvonne Kühne

Sojabohnen sind aufgrund ihres hohen Proteingehaltes ein wichtiges Nahrungsmittel und insbesondere bei Kindern ein häufig austretendes allergenes Lebensmittel. Der einizige zur Zeit mögliche Schutz vor einer allergischen Reaktion auf Soja ist die strikte Vermeidung der Aufnahme. Die allergenen Substanzen sind Proteine und Glykoproteine. Es gibt eine Reihe von Produkten aus Soja, die kein oder nur geringe Mengen Protein enthalten, aber in zahlreichen Lebensmitteln enthalten sind. Die Prüfung der potenziellen Allergenität von solchen Produkten, wie z.B. Vitamin E aus Soja, ist von grundlegendem Interesse für allergische Personen. Vitamin E aus Soja wird vielen Produkten z.B. als Antioxidanz zugesetzt und müsste nach den rechtlichen Kennzeichnungsvorschriften als Allergen auf der Verpackung angegeben werden. Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war daher die Entwicklung von sensitiven und spezifischen Detektionmethoden für den Nachweis von Sojaprotein in Tocopherol (VitaminE) aus der Sojabohne. Aber auch die Charakterisierung von Sojaallergenen für die Entwicklung von diagnostischen und therapeutischen Methoden ist wichtig. Das zweite Ziel der Arbeit war somit die genauere Charakterisierung von β- Conglycinin (Gly m 5) als Sojaallergen sowie die Identifizierung der IgE-bindenden Bereiche des untersuchten Proteins. Zum Nachweis, dass in dem hoch prozessierten Sojaprodukt Tocopherol kein Sojaprotein mehr vorhanden war, wurden mehrere proteinbiochemische und immunologische Methoden entwickelt und validiert. Der sojaspezifische ELISA zur Detektion von hydrophilen Sojaproteinen aus der Tocopherolmatrix mit einer realen Nachweisgrenze von 10 ppm zeigte eine gute Reproduzierbarkeit. Die Detektion von lipophilen, denaturierten und hydrophilen Sojaproteinen aus Tocopherol im Immunoblot mit einer Nachweisgrenze von 20 ppm war ebenfalls gut reproduzierbar. Der etablierte IgE Immunoblot mit Sojaallergikerseren wies eine vergleichbare Sensitivität auf. In keiner der 10 untersuchten Tocopherolproben wurde mit den etablierten sensitiven sojaspezifischen Methoden Sojaprotein detektiert. Bei in vivo Studien von klinischen Partnern wurde bei Sojaallergikern weder eine Reaktion auf Tocopherol im Hauttest noch in der oralen Provokation von 500 mg Tocopherol beobachtet. Dass Gly m 5 ein wichtiges Sojaallergen ist und als diagnostischer Marker für schwere allergische Reaktionen genutzt werden kann, wurde in einer früheren Publikation unserer Arbeitsgruppe beschrieben. Die genauere Charakterisierung von Gly m 5 in dieser Arbeit zeigte, dass es ein Hauptallergen bei sojaallergischen Kindern und bei Sojaallergikern mit anaphylaktischen Reaktionen darstellt. Dabei zeigten alle Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker spezifisches IgE gegen eine der drei Gly m 5 Untereinheiten, das Gly m 5.03. Diese Untereinheit kann somit als diagnostischer Marker für eine Gly m 5 Sensibilisierung eingesetzt werden. Es konnte ebenfalls in dieser Arbeit bestätigt werden, dass die meisten Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker moderate bis schwere allergische Reaktionen zeigten und Gly m 5 somit einen potenziellen Marker für die Schwere einer Sojaallergie darstellt. Zur Identifizierung von IgE-bindenden Bereichen des Gly m 5 und des homologen Erdnussallergens Ara h 1 wurde die hoch sensitive und spezifische CelluSpot Technik etabliert, welche im Vergleich zur häufig angewendeten SPOT Membran-Technik nicht nur Zeit und Serumvolumen spart, sondern auch die individuelle Testung der Seren unter ständiger Mitführung von Positiv-und Negativkontrollen ermöglichte. Diese Methode stellt damit eine geeignete Technik zur Untersuchung von IgE reaktiven linearen Bereichen der Gly m 5 Untereinheiten und des Ara h 1 dar. Die Mehrheit der Gly m 5 sensibilisierten Sojaallergiker besaß spezifisches IgE gegen sequenzielle synthetische Peptide der Gly m 5 Untereinheiten, wobei jedes Allergikerserum ein individuelles IgE Bindungsmuster zeigte. Zusammengefasst wurden fünf sequenzielle Regionen auf allen drei Gly m 5 Untereinheiten identifiziert, welche die größte IgE Bindungshäufigkeit aufwiesen. Alle fünf Bereiche waren zwischen 12-17 Aminosäuren groß und auf der Moleküloberfläche lokalisiert. Sie bildeten gemeinsam zwei zusammenhängende Bereiche in der Kernregion der Gly m 5 Moleküle und lassen vermuten, dass sie Teile von Konformationsepitopen darstellen. Zur Untersuchung einer möglicherweise vorhandenen serologischen Kreuzreaktivität zwischen den zwei Leguminosen Soja und Erdnuss, wurden sowohl Sojaallergiker mit Erdnussallergie als auch Erdnussallergiker ohne Sojaallergie auf Reaktivitäten gegen Peptide des Erdnussallergens Ara h 1 untersucht. Dabei wurden drei sequenzielle Bereiche identifiziert, die von der Mehrheit der Sojaallergiker, jedoch nur selten von den Erdnussallergikern erkannt wurden. Diese drei Bereiche wiesen eine Sequenzähnlichkeit zu den reaktivsten Bereichen der Gly m 5 Untereinheiten auf. Die Untersuchung von Allergikerseren auf Aminosäuresequenzebene könnte als diagnostische Methode zur Unterscheidung der klinischen Ausprägung einer Sojaallergie im Vergleich zur Erdnussallergie dienen und somit die Anzahl der risikobehafteten Nahrungsmittelprovokationen zur Bestätigung einer Sojaallergie senken. Die Identifizierung von B-Zell Epitopen ist eine wichtige Grundlage für die Herstellung von Hypoallergenen mit verringerter B-Zell Aktivität, bei gleichbleibender T-Zell- Aktivierung. Solche hypoallergenen Mutanten sind eine hoffnungsvolle Perspektive für eine Immuntherapie von Sojaallergikern, da sie womöglich das Risiko einer allergischen Reaktion während der Behandlung verringern können.

Regulierung des Ceramid - Sphingosin-1-Phosphat - Rheostats durch die neutrale Ceramidase und die Sphingosinkinase-1 in der Niere (2011)

Ankathrin Thekla Förster

Das Gleichgewicht zwischen den Sphingolipiden Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt eine entscheidende Rolle für das Schicksal einer Zelle. Es ist bekannt, dass Ceramid proapoptotisch wirkt, wohingegen S1P antiapoptotische und entzündungshemmende Signalwege induziert [6]. Eine Beeinflussung der Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme sowie eine daraus resultierende gestörte Balance zwischen Ceramid und S1P ist somit ein Merkmal diverser entzündlicher Krankheiten wie der Asthma bronchiale, der Colitis ulcerosa [148] oder auch verschiedenen Arten von Tumoren [199]. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Ceramid-abbauenden neutralen Ceramidase (NCDase) und der S1P-synthetisierenden Sphingosinkinase 1 (SK1) in verschiedenen Nierenzellen. Ein Fokus wurde dabei auf die Regulierung dieser Enzyme durch entzündungshemmende Corticosteroide in Ratten Mesangiumzellen gelegt, wobei diese Zellen entscheidend in der Entstehung entzündlicher Nierenerkrankungen wie einer Glomerulonephritis sind. Weiterhin wurde der Einfluss der Mutation putativer Phosphorylierungsstellen der NCDase auf die Regulierung dieses Enzyms in HEK293 Zellen untersucht und in einem dritten Teil der Arbeit schließlich die Expression und die Funktion der SK1 in der humanen Niere im Vergleich zum Nierenzellkarzinom analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide (GCs) Mesangiumzellen durch eine Steigerung der intrazellulären S1P-Konzentrationen vor durch Stress induzierter Apoptose schützen. Diese Beeinflussung des Sphingolipid-Rheostats beruhte auf einer gesteigerten mRNA- und Proteinexpression der Sphingosinkinase 1 (SK1) und der neutralen Ceramidase (NCDase). Außerdem wurde nachgewiesen, dass der Promotor der NCDase durch GCs aktivierbar ist und dass zwei Glucocorticoid-responsive-Elemente (GREs) innerhalb der Promotorsequenz durch die Bindung von Glucocorticoidrezeptoren (GRs) diese Aktivierung bewirken. In vivo Experimente mit isolierten Glomeruli, die aus mit Dexamethason behandelten Mäusen gewonnen wurden, zeigten ebenfalls eine Erhöhung der mRNA-Expression und Aktivität der SK1 sowie eine gesteigerte Proteinexpression der NCDase. Somit wurde erstmals ein direkter Einfluss von GCs auf den Sphingolipidmetabolismus in Mesangiumzellen beschrieben. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation zweier putativer Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen (T253A und T420/23A) in der Sequenz der murinen NCDase zu einem verlangsamten Reifungsprozess dieses Enzyms führt. Western Blot-Analysen ergaben, dass der überexprimierte NCDase-WT zwei unterschiedlich glykosylierte Isoformen mit einem Molekulargewicht von 120 und 130 kDa exprimiert, welche stetig durch einen aktiven Prozess sezerniert werden. Im Gegensatz dazu war in den Mutanten ausschließlich die 130 kDa-Form im Zellkulturüberstand und die 120 kDa-Form im Lysat zu finden. Im Zusammenfassung 129 Gegensatz zum WT lokalisierten die Mutanten lediglich an intrazellulären Membranen und nicht zusätzlich an der Plasmamembran. In Lysaten von Zellen die die Mutanten exprimierten, konnte eine verringerte relative Aktivität gemessen werden, die der sezernierten mutierten Formen hingegen war erhöht. Daher wurde vermutet, dass die 130 kDa-Form die reife Plasmamembran-gebundene und anschließend sezernierte, aktivere Isoform der NCDase darstellt. Die Inkubation von Mesangiumzellen mit Zellkulturüberständen, die den sezernierten NCDase-WT enthielten, führte zum Schutz vor durch Stress induzierter Apoptose. Somit kann eine auto- bzw. parakrine Funktion der sezernierten NCDase angenommen werden. Dem dritten Teil der Arbeit lag die erstmalige Beschreibung der SK1-Expression in der gesunden humanen Niere zugrunde. Es konnte gezeigt werden, dass diese im Zytoplasma sowie an Membranen von Zellen des proximalen Tubulus sowie in geringerem Maße in Podozyten und Mesangiumzellen des Glomerulus exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wurde die SK1 in Biopsien von Patienten mit Nierentumor im Nukleus gefunden. Die Untersuchung der SK1-Expression in 5 verschiedenen Nierentumorzelllinien im Vergleich zu Epithelzellen des proximalen Tubulus (Human Kidney 2 - HK2-Zellen) ergaben, dass sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expression der SK1 in Föhn-Zellen stark erhöht, in ACHN3-Zellen hingegen signifikant niedriger war. Zudem konnte auch in den Föhn-Zellen eine nukleäre Expression der SK1 nachgewiesen werden. Die Behandlung von HK2-, ACHN3- und Föhn-Zellen mit dem Transforming Growth Factor-ß2 (TGF-ß2) resultierte in einer transkriptionellen Steigerung der SK1-Expression. Die Herunterregulierung der SK1 in diesen Zellen führte zu einem Arrest der Zellen in der S Phase, wohingegen die Überexpression der SK1 in den ACHN3-Zellen zu einem signifikanten Schutz vor Apoptose führte. Zusammenfassend sind die Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme NCDase und SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit pathologischen Prozessen wie Entzündung, Apoptose und Proliferation einhergehen, wie es bei Glomerulonephritiden und bei Nierentumoren der Fall ist.

Nanopartikel als Trägersysteme für Doxorubicin zur Therapie von Gehirntumoren (2011)

Stefanie Wohlfahrt

Einleitung: Glioblastome, die aggressivsten malignen Gehirntumore, gehören zu den menschlichen Karzinomen mit der schlechtesten Prognose. Ihre Therapie stellt eine große Herausforderung dar. Eine komplette chirurgische Entfernung des Tumors ist auf Grund des infiltrativen Wachstums in gesundes Hirngewebe meist nicht möglich, und trotz der Standardtherapie, die Operation, Chemo- und Radiotherapie umfasst, sind die Behandlungserfolge nicht zufriedenstellend. Erschwerend kommt hinzu, dass das Gehirn vom übrigen Organismus durch die hochselektive Blut-Hirn-Schranke abgegrenzt ist, welche für viele potentiell wirksame therapeutische Substanzen eine Permeabilitätsbarriere darstellt. Somit stehen viele Zytostatika für die systemische Glioblastomtherapie nicht zur Verfügung und eine relative Therapieresistenz ist zu verzeichnen. Nicht nur die Neuentwicklung von Arzneistoffen für die Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie den Gehirntumoren, sondern auch die Etablierung neuer Arzneiformen zur kontrollierten, gewebsspezifischen Arzneistoffapplikation gewinnt immer mehr an Bedeutung. Ein Ansatz, der in der Vergangenheit vielversprechende Erfolge erzielte, ist die Einbettung von Arzneistoffen in kolloidale Trägersysteme wie polymere Nanopartikel oder Liposome. Diese Carrier sind in der Lage verschiedene Arzneistoffe über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren, damit diese im zentralen Nervensystem ihre Wirkung ausüben können. Der Grund für diesen Erfolg ist offensichtlich begründet in der nanopartikulären Größe und der besonderen Oberflächenstruktur dieser Träger. Zusätzlich geht mit der vermehrten Anreicherung der Wirkstoffe im Zentralnervensystem eine Verminderung der unerwünschten Arzneimittelwirkungen in peripheren Organen einher, was die Therapie positiv beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wird die antitumorale Effizienz nanopartikulärer Formulierungen, die den Wirkstoff Doxorubicin enthalten, eingehend untersucht. Hierbei liegt der Schwerpunkt auf der histologischen und immunhistochemischen Analyse der Gehirntumore, die eine genaue Differenzierung zwischen den Zubereitungen und eine aussagekräftige Effizienzbeurteilung erlaubt. Weiterhin wird der Fokus dieser Arbeit auf die Quantifizierung der Doxorubicinmenge gerichtet, die nach Applikation der nanopartikulären Formulierungen im Gehirn vorliegt. Enthält u.a. die Publikationen: Publikation 1: Transport of drugs across the blood-brain barrier by nanoparticles – A review Journal of Controlled Release – Special Issue: Drug delivery research in Europe Status: accepted, geplantes Erscheinungsdatum: 01.2012 Publikation 2: Increased numbers of injections of doxorubicin bound to nanoparticles lead to enhanced efficacy against rat glioblastoma 101/8 Wohlfart et al. 2009, Journal of Nanoneuroscience, Volume 1, Number 2, December 2009, pp. 144-151 (8) Publikation 3: Treatment of glioblastoma with poly (isohexyl cyanoacrylate) nanoparticles Wohlfart et al. 2011, International Journal of Pharmaceutics 415 (2011) 244-251 Publikation 4: Drug delivery to the brain using surfactant-coated poly (lactide-co-glycolide) nanoparticles: Influence of the formulation parameters Gelperina et al. 2010, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 74 (2010) 157–163 Publikation 5: Efficient chemotherapy of rat glioblastoma using doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles with different stabilizers Wohlfart et al. 2011, PloS One May 2011, Volume 6, Issue 5, e 19121 Publikation 6: Kinetics of transport of doxorubicin bound to nanoaprticles across the blood-brain barrier Wohlfart et al. 2011, Journal of Controlled Release (2011), doi:10.1016/j.jconrel.2011.05.010, in press

Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie (2010)

Miriam Ude

Bei chronischen Erkrankungen ist eine regelmäßige Arzneimitteleinnahme eine der Vo-raussetzungen für den Therapieerfolg. Trotzdem nehmen viele Patienten ihre Arzneimit-tel nicht wie vorgeschrieben ein. Dies kann im Rahmen von kardiovaskulären Erkrankun-gen (z. B. Hypertonie) schwerwiegende Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall haben. Es ist bekannt, dass die Therapietreue (Adhärenz bzw. Compliance und Persistenz) bei Hypertonikern nur bei 30 – 55 % liegt. Daher ist es von größter Wichtigkeit, die Therapie-treue und die Gründe für mangelnde Adhärenz zu erfassen, um danach gezielte Interven-tionen zur Verbesserung dieser entwickeln zu können. Allerdings liegen aus Deutschland zu dieser Thematik nur wenige Untersuchungen aus Feldstudien in Apotheken oder Ana-lysen aus Verordnungsdatenbanken vor. Um die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Ermittlung der Therapietreue großflä-chig abzudecken, wurden unterschiedliche Erfassungswege genutzt. Zum einen wurde eine Patientenbefragung in öffentlichen Apotheken zur Erfassung der Adhärenz und Ein-nahmegewohnheiten unter medikamentöser Therapie mit Antihypertensiva durchge-führt. Zum anderen diente die Analyse von Verordnungsdaten der DAPI-Datenbank dazu, die Persistenz und Compliance von Patienten unter antihypertensiver Therapie zu be-stimmen. Als Spezialfall wurde weiterhin betrachtet, ob die Umstellung von einem Origi-nal- auf ein generisches Ramipril-Präparat nach dessen Patentauslauf mit einer vermin-derten Compliance einhergeht. Die Patientenbefragung wurde sowohl von Patienten wie auch von den 24 teilnehmenden Apotheken gut angenommen. Dies zeigen die Rücklaufquoten der ausgegebenen Frage-bögen (46,8 % für die Befragung per zugesandtem Fragebogen (KF; kurze Form des Frage-bogens) und 32,8 % für das Interview in der Apotheke (LF; lange Form des Fragebogens)) Gemessen anhand des eingesetzten Adhärenz-Scores beschrieben sich 71,9 % der Patien-ten im LF und 58,2 % im KF selbst als adhärent. Der Bedarf für strukturierte, einfach durchführbare Adhärenz-Erfassungsinstrumente für die öffentliche Apotheke wurde sehr deutlich, wie u. a. der Abschlussbericht, welcher von den Apotheken nach Abschluss der Befragung ausgefüllt wurde, zeigte. Demnach hielten die Apotheken die Befragung von Umfang und Verständlichkeit für angemessen. Die Patienten waren bereit, detaillierte Kapitel V Zusammenfassung V Dissertation Miriam Ude Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie 160 Auskünfte über ihre Erkrankung zu geben. Dies zeigten auch die vielen in den Bogen ein-getragenen Anmerkungen seitens der Patienten und Apothekern, in denen individuelle Probleme dokumentiert wurden. Bei der Analyse von Persistenz und Compliance im Substanzklassenvergleich wurde ein-drücklich gezeigt, dass die Therapietreue unter den First-line-Antihypertensiva (AHT) sub-optimal ist. Patienten unter der Therapie mit β-Blockern (77,3 %) weisen den geringsten non-persistenten Anteil auf, gefolgt von Patienten mit Verordnungen über ACE-Hemmer (78,7 %), AT1-Antagonisten (79,0 %), Calcium-Kanal-Blocker (81,4 %) und Diuretika (83,0 %). Hinsichtlich der Compliance findet sich in der Gruppe der mit AT1-Antagonisten be-handelten Patienten der niedrigste Anteil mit Non-Compliance (52,1 %), gefolgt von ACE-Hemmern (54,1 %), β-Blockern (54,7 %), Calcium-Kanal-Blockern (58,5 %) und Diuretika (63,6 %). Die primäre Hypothese, dass die Compliance nach Umstellung von einem Ramipril-Original-Präparat nach dessen Patentauslauf auf ein Generikum signifikant abnimmt, konnte nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden für Patienten ermittelt, welche mit Ramipril-Monopräparaten, nur mit Fixkombinationen aus Ramipril mit einem Diuretikum, oder mit beidem (duale Therapie) behandelt wurden. Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Projekte zeigen, dass die medikamentöse Therapietreue bei Patienten unter antihypertensiver Therapie in Deutschland verbesserungswürdig ist, und dass die Ermittlung der Adhärenz, Compliance und Persistenz von immenser Wichtigkeit ist. Trotz der unterschiedlichen gewählten An-sätze kongruieren die Ergebnisse sehr gut. Patienten benötigen Unterstützung in der Durchführung ihrer medikamentösen Therapie mit AHT, um gesteckte Therapieziele zu erreichen, welche dazu beitragen können, Morbidität und Mortalität zu verringern bzw. die Lebensqualität zu verbessern. Ein erster Schritt dazu ist das zielgerichtete Erkennen therapiebezogener Probleme. Da es hierfür in Deutschland bisher keine strukturierten Instrumente gibt, welche flächendeckend in den Apothekenalltag implementiert wurden, könnte das neu entwickelte und auf Machbarkeit getestete Befragungsinstrument ein Ansatz sein, die Patienten gezielt und zeitsparend nach ihren Problemen mit der Arznei-mitteleinnahme zu befragen und frühestmöglich intervenieren zu können.

Identifizierung neuer antibiotischer Substanzen mittels verschiedener Bioassays und Massenspektrometrie / von Dorota Anna Urbanek (2011)

Dorota Urbanek

In dieser Arbeit sollten auf Grundlage eines in vitro Transkriptions-/Translations-Assays (TTA) neue Substanzen als Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese gefunden werden. Um dieses Ziel verfolgen zu können, wurde zuerst ein zellfreies Testsystem aus kommerziellen Komponenten entwickelt und als Screening-Tool für Inhibitoren der bakteriellen Proteinbiosynthese evaluiert. Anhand des allgemein akzeptierten Bewertungskriteriums Z‘-Faktor konnte die Performance des etablierten Assays als exzellent eingeordnet werden. Mit diesem System war es nun möglich, Substanzen aus unterschiedlichen Quellen bei der Wirkstoffsuche als potentielle Antibiotika einzuordnen, welche die Proteinbiosynthese hemmen. In zwei nachfolgenden Projekten wurde die Praktikabilität dieses neuen Assays bei der Auffindung möglicher Antibiotika-Kandidaten bewiesen. In dem ersten Ansatz wurde ein virtuelles Screening der Substanzdatenbanken Specs und Asinex anhand eines Pseudorezeptormodells für Aminoglykoside durchgeführt. In Kombination mit dem TTA sowie einem Ganzzell-Assay gegen den gram-positiven Keim Bacillus subtilis 168 konnte eine Struktur mit Ähnlichkeit zu Vanilloiden als interessanter Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen identifiziert werden. Die Entdeckung korreliert mit den antimikrobiellen Eigenschaften eines anderen Vanilloid, dem Capsaicin, für welches bisher aber keine Hemmung der Proteinbiosynthese in der Literatur beschrieben ist. Somit konnte gezeigt werden, dass anhand eines virtuellen Screenings sowie weiterer Assays neue Hemmer der bakteriellen Proteinbiosynthese effizient und effektiv gefunden werden können. In einem zweiten Screening-Projekt dienten pflanzliche Naturstoffe als Substanzquelle. Hierfür wurden auf der Grundlage der diterpenoiden Fusidinsäure, einem Proteinbiosynthesehemmer (PBS-Hemmer), tetra-und pentazyklische Isoprenoide ausgewählt. Aus einem Ensemble von terpenoiden Strukturen gingen nach TTA und einem zellbasierten Assay gegen Bacillus subtilis 168 in absteigender Aktivität die 18β-Glycyrrhetinsäure, 11- Keto-β-boswelliaäsure und Carnosolsäure als nennenswerte antimikrobiell wirksame Vertreter und PBS-Hemmer hervor. Auch zeigten sich diese Substanzen den Stoffen aus dem virtuellen Screening sowohl im TTA als auch in der Wirksamkeit gegen Bacillus subtilis 168 deutlich überlegen. Im nächsten Schritt erfolgte deshalb nur für diese drei Terpenoide eine Charakterisierung ihrer Auswirkungen auf das Proteom des gram-positiven Bakteriums Bacillus subtilis 168. Zusammenfassung 131 Dafür wurde eine komplette zweidimensionale gelelektrophoretische Methodik basierend auf der Differentiellen Gelelektrophorese (DIGE) etabliert. Sie umfasst eine Strategie zur schnellen Evaluierung der optimalen Anzucht des Testkeims Bacillus subtilis 168 unter Einfluss einer antimikrobiell wirksamen Substanz und ein einfaches Aufschlussverfahren, um einen kompatiblen Proteinextrakt für DIGE zu erhalten. Außerdem wurde ein preisgünstiges Markierungsverfahren mit dem 5(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimid-Ester als Alternative zu den teuren DIGE-Cyan-Farbstoffen entwickelt, um die Fluoreszenzbildqualität eines neuen unbekannten Extraktes vor dem eigentlichen kostspieligen DIGE-Versuch zu überprüfen. Eine Quantifizierung regulierter Spots im Gel ist mit diesem billigen Verfahren ebenfalls möglich, stellt aber keinen Ersatz für den DIGE-Versuch dar. Die Ergebnisse der quantitativ vergleichenden Proteomanalyse vom behandelten und unbehandelten Bacillus subtilis 168 mittels DIGE bieten erstmals einen Einblick in die Einflussnahme der drei Terpenoide 18β-Glycyrrhetinsäure, 11-Keto-ß-boswelliaäsure und Carnosolsäure auf die Stressregulation und die Stoffwechseländerungen dieses Bakteriums. Außerdem beinhaltet die Arbeit einen Abgleich, inwieweit andere antimikrobiell wirksame Substanzen die regulierten Proteine der drei untersuchten Naturstoffe bei Bacillus subtilis 168 beeinflussen können. Aus den erhobenen Daten konnte dann ein Wirkmechanismus für 18β- Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure postuliert werden. 18β-Glycyrrhetinsäure greift wahrscheinlich am membranständigen Lipid-II-System der bakteriellen Zellwand an, da wie bei den Antibiotika Vancomycin, Nisin, Daptomycin, Ramoplanin und Bacitracin das Zellwandstress-Regulationsnetzwerk (LiaRS-System) als Warnsystem aktiviert wird. Außerdem konnte für 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure eine Theorie für Ihre PBSHemmung entwickelt werden. Beide beeinflussen gegebenenfalls die GTPase-Aktivität des Translationsfaktors EF-G durch Interaktion mit dem ribosomalen Bindezentrum für Translationsfaktoren. Dieses Bindungszentrum ist neben der dekodierenden Region auf der ribosomalen 30S-Untereinheit und dem Peptidyltransferase-Zentrum auf der ribosomalen 50S-Untereinheit eine extrem wichtige Region für die Funktionalität eines Ribosoms. Fusidinsäure greift auch an dieser Stelle an, indem es den EF-G-GDP-Ribosomkomplex stabilisiert. Natürlich wären weitere Studien nötig, z. B. eine Röntgenstrukturanalyse der Ribosomen von 18β-Glycyrrhetinsäure und Carnosolsäure behandelten Bakterien, um die Bindestelle für die PBS-Hemmung zweifelsfrei zu bestätigen.

Impact of tumour microenvironmental factors on dendritic cell differentiation and function (2012)

Divya Sekar

Um der Erkennung durch das körpereigene Immunsystem entkommen, weisen Tumore Modifikationen in ihrer Mikroumgebung auf. Zu diesen gehören u. a. veränderte Sauerstoffkonzentrationen im Tumorkern und die Freisetzung biochemischer Faktoren aus Tumorzellen, welche die Funktion von Tumor-assoziierten Phagozyten, wie z.B. Dendritischen Zellen (DC) beeinflussen. DC sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die eine Spezialisierung in verschiedene funktionale Subtypen aufweisen. Myeloische DC (mDC) sind besonders effizient in Hinsicht auf die Präsentation von Antigenen, wohingegen plasmazytoide DC (pDC) regulatorisch auf das Immunsystem einwirken. Beide Subtypen spielen eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese. Während humane mDC, zur therapeutischen Verwendung, ex vivo aus Monozyten hergestellt werden können, war dies für humane pDC bisher nicht möglich. Ein war deshalb ein erstes Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zur Generierung humaner pDC aus humanen Monozyten zu entwickeln. Diese wurden mittels des Wachstumsfaktors Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt3-L) zu pDC-Äquivalenten differenziert, welche als monocyte-derived pDC (mo-pDC) bezeichnet wurden. In der Tat zeigten mo-pDC ein für humane pDC charakteristisches Oberflächenmarkerprofil und wiesen, im Vergleich zu mDC, eine geringe Kapazität zur Induktion der Proliferation autologer T Zellen und zur Phagozytose apoptotischer Zellen auf. Mo-pDC erwarben im Verlauf ihrer Differenzierung aus Monozyten eine kontinuierlich erhöhte Expression des pDC-spezifischen Transkriptionfaktors E2-2 und seiner spezifischen Zielgene. Der wichtigste funktionale Parameter von pDC ist die Produktion großer Mengen von Interferon-α (IFN-α). Mo-pDC sezernierten, nach vorheriger Aktivierung mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) oder wenn zu ihrer Differenzierung neben Flt3-L auch Vitamin D3 oder all-trans-Retinolsäure verwendet wurde, ebenfalls große Mengen IFN-α. Wurden mo-pDC unter Hypoxie, einem prominenten Faktor der Tumormikroumgebung, generiert, so waren die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors E2-2 und die Freisetzung von IFN-α stark vermindert. Diese Daten zeigten zunächst, dass mo-pDC für das Studium von Differenzierung und Funktion humaner pDC eingesetzt werden können. Weiterhin lieferten sie Hinweise auf eine veränderte Differenzierung humaner pDC unter Hypoxie. In einem nächsten Schritt wurde folglich untersucht, ob Hypoxie auch die Differenzierung von pDC aus deren physiologischen Vorläufern beeinflusst. Wurden Knochenmarkszellen der Maus mit Flt3-L unter Normoxie oder Hypoxie kultiviert, so war die Differenzierung zu pDC unter Hypoxie in der Tat unterdrückt. Dies war abhängig von der Hypoxie-induzierten Aktivität des Hypoxie-induzierten Faktors 1 (HIF-1), da die Flt3-Linduzierte Differenzierung von murinen Knochenmarkszellen, in denen die Expression von HIF-1 in pDC-Vorläuferzellen ausgeschaltet war, unter Hypoxie normal verlief. Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass Hypoxie, durch Aktivierung von HIF-1, Differenzierung und Funktion von pDC unterdrückt. Dieser Mechanismus könnte zu ihrer beschriebenen Dysfunktion in humanen Tumoren beitragen. Neben Hypoxie sind viele andere Faktoren an der Immunsuppression in Tumoren beteiligt. Eine Komponente der Mikroumgebung in Tumoren ist das Vorhandensein apoptotischer Tumorzellen. Apoptose von Tumorzellen findet, im Kontrast zur generellen Sicht von Tumoren als Apoptose-resistente Entitäten, auch in unbehandelten Tumoren im Überfluss statt. Apoptotische körpereigene Zellen unterdrücken unter physiologischen Bedingungen das Immunsystem. Deshalb könnte das Freisetzen von apoptotischem Material oder die Sekretion von Faktoren aus sterbenden Tumorzellen einen starken Einfluss auf die Funktion von Tumor-assoziierten DC und die damit verbundene Aktivierung von tumoriziden Lymphozyten haben. Eine diesbezügliche Studie war das zweite Ziel der vorliegenden Arbeit. Humane mDC wurden zu diesem Zweck mit Überständen lebender, apoptotischer oder nekrotischer humaner Brustkrebszellen aktiviert und anschließend mit autologen T Zellen ko-kultiviert. Danach wurde das zytotoxische Potential der ko-kultivierten T Zellen analysiert. Interessanterweise unterdrückte die Aktivierung mit Überständen apoptotischer Tumorzellen die DC-vermittelte Generierung tumorizider T Zellen durch die Ausprägung einer Population von regulatorischen T Zellen (Treg), die durch die gleichzeitige Expression der Oberflächenmoleküle CD39 und CD69 charakterisiert war. Die Ausprägung der CD39- und CD69-exprimierenden Treg Zell-Population war abhängig von der Freisetzung des bioaktiven Lipids Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aus apoptotischen Zellen, welches durch den S1P-Rezeptor 4 zur Freisetzung des immunregulatorischen Zytokins IL-27 aus mDC führte. Neutralisierung von IL-27 in AC-aktivierten Ko-Kulturen von mDC und T Zellen blockierte die Generierung von CD39- und CD69-exprimierenden Treg Zellen und resultierte folglich in der Aktivierung zytotoxischer T Zellen. Weiterhin war die Bildung von Adenosin in den Ko- Kulturen für die Unterdrückung zytotoxischer T Zellen vonnöten. Erste Experimente lieferten Hinweise auf eine direkte Interaktion von CD69- und CD39-exprimierenden Treg Zellen mit CD73-exprimierenden zytotoxischen T Zellen. CD39 und CD73 werden für die Bildung von Adenosin aus ATP benötigt, weswegen die Interaktion von Treg Zellen und zytotoxischen T Zellen die Adenosin-Produktion fördern könnte. Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Befunde wie Faktoren der Tumormikroumgebung die Funktion von humanen DC Subtypen beeinflussen können. Ein Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen kann wertvolle Informationen für die Wahl effektiver Immuntherapien oder Chemotherapien liefern und so die Therapie humaner Tumore unterstützen.

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