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Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie
(2010)
- Bei chronischen Erkrankungen ist eine regelmäßige Arzneimitteleinnahme eine der Vo-raussetzungen für den Therapieerfolg. Trotzdem nehmen viele Patienten ihre Arzneimit-tel nicht wie vorgeschrieben ein. Dies kann im Rahmen von kardiovaskulären Erkrankun-gen (z. B. Hypertonie) schwerwiegende Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall haben. Es ist bekannt, dass die Therapietreue (Adhärenz bzw. Compliance und Persistenz) bei Hypertonikern nur bei 30 – 55 % liegt. Daher ist es von größter Wichtigkeit, die Therapie-treue und die Gründe für mangelnde Adhärenz zu erfassen, um danach gezielte Interven-tionen zur Verbesserung dieser entwickeln zu können. Allerdings liegen aus Deutschland zu dieser Thematik nur wenige Untersuchungen aus Feldstudien in Apotheken oder Ana-lysen aus Verordnungsdatenbanken vor. Um die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Ermittlung der Therapietreue großflä-chig abzudecken, wurden unterschiedliche Erfassungswege genutzt. Zum einen wurde eine Patientenbefragung in öffentlichen Apotheken zur Erfassung der Adhärenz und Ein-nahmegewohnheiten unter medikamentöser Therapie mit Antihypertensiva durchge-führt. Zum anderen diente die Analyse von Verordnungsdaten der DAPI-Datenbank dazu, die Persistenz und Compliance von Patienten unter antihypertensiver Therapie zu be-stimmen. Als Spezialfall wurde weiterhin betrachtet, ob die Umstellung von einem Origi-nal- auf ein generisches Ramipril-Präparat nach dessen Patentauslauf mit einer vermin-derten Compliance einhergeht. Die Patientenbefragung wurde sowohl von Patienten wie auch von den 24 teilnehmenden Apotheken gut angenommen. Dies zeigen die Rücklaufquoten der ausgegebenen Frage-bögen (46,8 % für die Befragung per zugesandtem Fragebogen (KF; kurze Form des Frage-bogens) und 32,8 % für das Interview in der Apotheke (LF; lange Form des Fragebogens)) Gemessen anhand des eingesetzten Adhärenz-Scores beschrieben sich 71,9 % der Patien-ten im LF und 58,2 % im KF selbst als adhärent. Der Bedarf für strukturierte, einfach durchführbare Adhärenz-Erfassungsinstrumente für die öffentliche Apotheke wurde sehr deutlich, wie u. a. der Abschlussbericht, welcher von den Apotheken nach Abschluss der Befragung ausgefüllt wurde, zeigte. Demnach hielten die Apotheken die Befragung von Umfang und Verständlichkeit für angemessen. Die Patienten waren bereit, detaillierte Kapitel V Zusammenfassung V Dissertation Miriam Ude Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie 160 Auskünfte über ihre Erkrankung zu geben. Dies zeigten auch die vielen in den Bogen ein-getragenen Anmerkungen seitens der Patienten und Apothekern, in denen individuelle Probleme dokumentiert wurden. Bei der Analyse von Persistenz und Compliance im Substanzklassenvergleich wurde ein-drücklich gezeigt, dass die Therapietreue unter den First-line-Antihypertensiva (AHT) sub-optimal ist. Patienten unter der Therapie mit β-Blockern (77,3 %) weisen den geringsten non-persistenten Anteil auf, gefolgt von Patienten mit Verordnungen über ACE-Hemmer (78,7 %), AT1-Antagonisten (79,0 %), Calcium-Kanal-Blocker (81,4 %) und Diuretika (83,0 %). Hinsichtlich der Compliance findet sich in der Gruppe der mit AT1-Antagonisten be-handelten Patienten der niedrigste Anteil mit Non-Compliance (52,1 %), gefolgt von ACE-Hemmern (54,1 %), β-Blockern (54,7 %), Calcium-Kanal-Blockern (58,5 %) und Diuretika (63,6 %). Die primäre Hypothese, dass die Compliance nach Umstellung von einem Ramipril-Original-Präparat nach dessen Patentauslauf auf ein Generikum signifikant abnimmt, konnte nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden für Patienten ermittelt, welche mit Ramipril-Monopräparaten, nur mit Fixkombinationen aus Ramipril mit einem Diuretikum, oder mit beidem (duale Therapie) behandelt wurden. Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Projekte zeigen, dass die medikamentöse Therapietreue bei Patienten unter antihypertensiver Therapie in Deutschland verbesserungswürdig ist, und dass die Ermittlung der Adhärenz, Compliance und Persistenz von immenser Wichtigkeit ist. Trotz der unterschiedlichen gewählten An-sätze kongruieren die Ergebnisse sehr gut. Patienten benötigen Unterstützung in der Durchführung ihrer medikamentösen Therapie mit AHT, um gesteckte Therapieziele zu erreichen, welche dazu beitragen können, Morbidität und Mortalität zu verringern bzw. die Lebensqualität zu verbessern. Ein erster Schritt dazu ist das zielgerichtete Erkennen therapiebezogener Probleme. Da es hierfür in Deutschland bisher keine strukturierten Instrumente gibt, welche flächendeckend in den Apothekenalltag implementiert wurden, könnte das neu entwickelte und auf Machbarkeit getestete Befragungsinstrument ein Ansatz sein, die Patienten gezielt und zeitsparend nach ihren Problemen mit der Arznei-mitteleinnahme zu befragen und frühestmöglich intervenieren zu können.
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Untersuchungen zur Membranfluidität als regulatorisches Element der APP-Prozessierung
(2007)
- Extrazelluläre Ablagerungen aus aggregierten Abeta-Peptiden stellen das pathologische Hauptmerkmal der Alzheimer Demenz dar. Schrittweise Veränderungen der Gleichgewichtsspiegel an Abeta im Gehirn begründen den Beginn der Amyloid Kaskaden Hypothese, in deren Folge es zu einer vermehrten Bildung und Aggregation von Abeta kommt. Im Zuge dieser Arbeit wurde im Zellmodell untersucht, welche Faktoren die Aggregation und die Bildung von Abeta initiieren bzw. verstärken. Etliche Arbeiten deuten darauf hin, dass der Amyloid-Metabolismus eng mit dem zellulären Cholesteringehalt verknüpft ist. In den hier verwendeten Modellsystemen bestätigte sich dieser Befund, da die Reduktion von Cholesterin durch Lovastatin und selektive Inhibitoren der Cholesterinbiosynthese mit einer signifikanten Abnahme der Abeta-Produktion einherging. Der Statin-Effekt konnte dabei nachweislich auf die Cholesterinreduktion bezogen und gegenüber pleitropen Isoprenoid-Effekten abgegrenzt werden, da die Inhibition der Isoprenoid- Transferasen FTase und GGTase zu keiner verminderten Abeta-Sekretion führte. Für eine mechanistische Analyse wurde die Rolle des freien Cholesterins als determinierender Faktor der Membranfluidität untersucht. Die APP-Prozessierung ist in der Membran lokalisiert und unterliegt daher dem Einfluss von Cholesterin als Modulator der physikalisch-chemischen Membraneigenschaften. Die Reduktion von Cholesterin bewirkt eine Zunahme der Membranfluidität, während hohe Cholesterinspiegel zu einer starren Membran führen. Beide Zustände wurden unabhängig vom Cholesteringehalt durch den Membranfluidizer Benzyl-Alkohol und den Membranrigidizer Pluronic F68 simuliert. Die Zunahme der Membranfluidität nach der Behandlung mit Benzyl Alkohol resultierte in einer signifikant verminderten Abeta-Sekretion. Pluronic F68 hingegen führte cholesterinunabhängig zu einer Abnahme an Membranfluidität, die mit einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung einherging. Die Befunde weisen die Membranfluidität explizit als regulatorisches Element der Abeta-Produktion aus. Benzyl Alkohol und Pluronic F68 zeigten außerdem eine starke Beeinflussung der Membranorganisation in Bezug auf die Formation von Lipid Rafts als potentielle Domänen der amyloidogenen APP-Prozessierung. Benzyl Alkohol führte zu einer diffusen Lokalisation von GM-1 und Cholesterin, während Pluronic F68 eine Kondensation der Raftlipide bewirkte. Abeta selbst interagiert mit der Plasmamembran und stört deren Integrität. Eine Reihe von Daten deutet darauf hin, dass Abeta spezifisch an Komponenten der Lipid Rafts bindet. Die vorliegende Arbeit bestätigt die Kolokalisation von GM-1 und Abeta und belegt, dass die Interaktion zu einer Abnahme der Membranfluidität führt. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass die Bindung von Abeta zu einer verstärkten amyloidogenen APP-Prozessierung führt und so einen selbstverstärkenden Mechanismus der Abeta-Produktion initiiert. Der Effekt konnte in proliferierenden Zellen durch langfristige Inhibition der Abeta-Sekretion rückgängig gemacht werden. Anhand der Ergebnisse wurde ein Modell entworfen, in dem die Aggregation von gebundenem Abeta zu einer Vernetzung von Lipid Rafts führt und so die amyloidogene APP-Prozessierung stimuliert. Die Hypothese wurde mit Hilfe von Antikörperinduzierter Quervernetzung von GM-1 überprüft und bestätigt. Zusammengenommen zeigt die vorliegende Arbeit, dass 1.) die Lovastatin-induzierte Abnahme der Abeta-Sekretion in den verwendeten Zellmodellen auf die Reduktion von Cholesterin, bzw. die daraus resultierende Zunahme der Membranfluidität zurückzuführen ist, 2.) die Membranfluidität unabhängig vom Cholesteringehalt Einfluss auf die APP-Prozessierung nimmt, wobei eine fluide Membran die nicht-amyloidogene und eine starre Membran die amyloidogene APP-Prozessierung begünstigt, 3.) die Vernetzung bzw. Kondensation von Lipid Rafts zu einer verstärkten amyloidogenen Prozessierung führt und 4.) Abeta selbst durch Bindung an die Membran diesen Zustand bedingt und damit einen Teufelskreislauf initiiert, in dem es die eigene Produktion stimuliert. Damit fügt die Arbeit dem Puzzle um die Genesis der sporadischen Form der Alzheimer Demenz einige Stücke hinzu und bietet neue Aspekte für die therapeutische Intervention der Erkrankung an.
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Mitochondriale Dysfunktion als gemeinsame Endstrecke verschiedener Risikofaktoren der Alzheimer-Erkrankung
(2007)
- Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen bestehend aus dem Amyloidbeta-Peptid (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der AD spielt. Mit Hilfe von dissoziierten Hirnzellen von NMRI, Thy1-APP-, P301L Tau- und JNK-Knockout-Mäusen wurden Veränderungen, verursacht durch genetisch, alters- und geschlechtsbedingten Risikofaktoren, auf die mitochondriale Funktion untersucht. Die Abeta-Belastung der untersuchten Thy1-APP Mäuse führte zu einer mitochondrialen Fehlfunktion durch intrazelluläres Abeta und damit zu einem Energiedefizit. Aß hemmte die Atmungskette, vor allem die COX-Aktivität, indem es an die COX-Untereinheit bindet und damit die Anlagerung von Cytochrom C verhindert. Eine zusätzliche Mutation wie PS1M146L verursacht eine größere und früher einsetzende Abeta-Akkumulation im Gehirn der Mäuse und führte zu größerer mitochondrialer Schädigung im Vergleich zu den APP transgenen Mäusen. Der Grad der Abeta-Schädigung ist auch von dem Aggregationszustand von Abeta abhängig. Eine Akkumulation von intra- und extrazellulären Oligomeren reicht aus, um das mitochondriale Membranpotential zu erniedrigen. Die Aß-Belastung nimmt im Alter zu und es bilden sich ab dem 6. Monat Amyloid-Plaques im Gehirn der Thy1-APP Mäuse aus, die zu einem veränderten Verhältnis von Bcl-xL und Bax in Richtung Bax führten. Bax und Bcl-2 sind an der Bildung der mitochondrialen Pore beteiligt. Durch die Öffnung der mitochondrialen Pore sinkt das mitochondriale Membranpotential und die ATP-Spiegel. Bax begünstigt zusätzlich die Freisetzung von Cytochrom C und Smac. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die geringen ATP-Spiegel und die Cytochrom C Freisetzung werden mit der Apoptose in Verbindung gebracht und erklären die erhöhte Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber oxidativem Stress. Desweiteren muss die JNK3 berücksichtigt werden. Sie ist der mitochondrialen Fehlfunktion vorgeschaltet und löst eine degenerative Apoptose aus. Abeta und Tau werden bei der Entstehung von AD miteinander in Verbindung gebracht. Dieser Synergismus führt zu einer mitochondrialen Fehlfunktion im Kortex der Mäuse. Aufgrund des unveränderten Transmembranpotentials der dissoziierten Hirnzellen im Gehirn der Thy1APP Mäuse ab dem 6. Monat scheinen nur die aggregierten Polypeptide für die Neurotoxizität bei der AD eine Rolle zu spielen. Die COX-Aktivität wurde im Alter ebenfalls wieder verbessert und stabilisierte dadurch die ATPSpiegel. Die P301L-Taumäuse entwickeln ebenfalls erst im Alter neurofibrilläre Bündel (NFT) durch die Akkumulation von hyperphosphorylierten Tau. Ab dem 2. Lebensjahr der Mäuse wurde ein starker signifikanter Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATPSpiegel beobachtet. Der Anstieg der ROS-Spiegel der zwei Jahre alten Mäuse führte direkt zu einer Reduzierung der Komplex-I-Aktivität. Für diese Neurotoxizität scheint die Bildung der NFT verantwortlich zu sein. Die Wirkung von Ginkgo-biloba-Extrakt (EGb 761) und Piracetam auf die mitochondriale Fehlfunktion in jungen und alten NMRI-Mäusen untersucht. Eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials und die Normalisierung der ATP-Spiegel konnte mit Hilfe von EGb 761 und Piracetam festgestellt werden. Besonders bei alten Mäusen konnte die schon angefangene mitochondriale Fehlfunktion fast komplett kompensiert werden. EGb 761 und Piracetam waren in der Lage nach zweiwöchiger Behandlung der APP transgenen Mäusen die löslichen Abeta-Spiegel im Gehirn signifikant zu senken. Durch diese Entlastung wurde die durch Abeta-verursachte Destabilisierung der mitochondrialen Membranen aufgehoben und die Mitochondrien vor oxidativen Schädigungen geschützt. Drei wichtige Angriffspunkte werden aufgrund der Daten für Piracetam vorgeschlagen: 1. die Senkung der Abeta-Spiegel im Gehirn, 2. die Stabilisierung der mitochondrialen Membranen und eine dadurch verbesserte Membranfluidität und 3. die Verbesserung der mitochondrialen Funktion vor altersbedingten Schädigungen. Die drei Punkte sind miteinander verknüpft, aufgrunddessen, dass Abeta die mitochondriale Membranen destabilisiert und dies zu einer mitochondrialen Fehlfunktion führen kann. Die neuroprotektiven Effekte von EGb 761 wurden durch 1. Senkung der Aß-Spiegel, 2. Mitochondrienmembranstabilisierende Wirkungen, 3. antioxidative Effekte, und 4. durch Modulation von Chloridkanälen hervorgerufen. In APP transgenen Mäusen wird trotz gleicher APP Expression in weiblichen Mäuse eine erhöhte Beta-Sekretasespaltung von APP mit verstärkter Bildung von C99 und Abeta (unlösliches und lösliches) im Vergleich zu den männlichen Tieren gebildet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass die erhöhten Abeta-Spiegel und der damit verbundene oxidative Stress in transgenen Mäusen zusätzlich die Mitochondrien der weiblichen Tiere besonders schädigen und die Atmungskette beeinträchtigen. Damit bestätigt sich, dass das Geschlecht ein weiterer Risikofaktor der AD ist. Daher unterstützen die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Befunde grundsätzlich die weitere Erforschung pharmakologischer Ansätze besonders von Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zur Verbesserung kognitiver Störungen als Therapie oder auch zur Prophylaxe der Alzheimer Krankheit. Der Schutz von EGb 761 und Piracetam auf die Mitochondrien vor oxidativem Stress kann daher zur Vorbeugung vor allgemeinen Alterungsprozessen dienen. Abeta und Tau spielen zusammen beim Untergang der Neurone eine große Rolle. Therapien, welche die Ablagerungen von Abeta im Gehirn verringern, sollten in einem frühen Stadium der Krankheit besonders wirksam sein. In einem späteren Stadium wären hingegen zusätzlich Medikamente nötig, die gegen die neurofibrilläre Bündel gerichtet sind. Damit ließe sich theoretisch der fortschreitende Zelluntergang bei Alzheimerpatienten zu mindestens verlangsamen.
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Beeinflussung der Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins durch Veränderungen des intrazellulären pH-Wertes : Untersuchungen mit Hyperforin
(2004)
- Substanzen, die den intrazellulären pH-Wert beeinflussen, verändern den proteolytischen Abbau des Amyloidvorläuferproteins (APP) teilweise so, dass weniger Beta-Amyloid (A-Beta) entsteht. A-Beta ist nach heutigen Vorstellungen als Hauptbestandteil der senilen Plaques kausal in die Pathogenese der Alzheimer´schen Erkrankung involviert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zu überprüfen, ob Hyperforin, ein wichtiger Inhaltsstoff des Johanniskrauts, in der Lage ist, in die APP-Prozessierung einzugreifen und eine Verschiebung der proteolytischen Spaltung von APP, die das Entstehen der senilen Plaques möglicherweise verringert, auszulösen, da bekannt war, dass Hyperforin den intrazellulären pH-Wert in Thrombozyten verändert. Für die Arbeit wurden untransfizierte und stabil transfizierte PC12 und HEK Zellen, zwei in der Alzheimer-Forschung geläufige Zell-Modelle, verwendet. Die Zellen waren entweder mit menschlichem wild-typ APP (APPwt) oder mit APP, das die schwedische Mutation beinhaltet (APPsw), eine Alzheimer-relevante Mutation, die einen frühzeitigen Erkrankungsbeginn zur Folge hat, stabil transfiziert. Um die Relevanz möglicher Hyperforin-Effekte abschätzen zu können, wurden PMA (Phorbolester, bekannter Alpha-Sekretase-Aktivator), Bafilomycin A1 (V-ATPase-Hemmer) und FCCP (Protonophor), für die eine Beeinflussung der APP-Prozessierung bekannt ist, zum Vergleich mit untersucht. Als erstes wurden an den verwendeten Zell-Linien die intrazellulären pH-Wert-Veränderungen durch Hyperforin, FCCP und Bafilomycin A1 gemessen und miteinander verglichen, wobei Hyperforin und FCCP den intrazellulären pH-Wert in gleichen Konzentrationsbereichen ähnlich schnell und stark reduzierten, während Bafilomycin A1 den intrazellulären pH-Wert kaum beeinflusste. Es konnte kein Einfluss von Transfektion und Mutation auf die Empfindlichkeit der intrazellulären pH-Wert-Verschiebung gefunden werden. Mögliche zelltoxische Eigenschaften von Hyperforin, PMA, FCCP und Bafilomycin A1 wurden überprüft, wobei auch ein Einfluss von Hyperforin und FCCP auf die Mitochondrien getestet wurde. Die Quantifizierung möglicher zytotoxischer Eigenschaften der Substanzen mittels MTT- und LDH-Tests ergaben, dass alle Ergebnisse bis zu einer Inkubationsdauer von 2 Stunden nicht auf eine Bioaktivitätsstörungen der Zellen zurückzuführen sind. Auch wenn Hyperforin, ähnlich wie FCCP, die Mitochondrien depolarisierte. Als nächstes wurde der mögliche Einfluss von Hyperforin auf die proteolytische Prozessierung von APP untersucht. Von Interesse war, ob ein Zusammenhang zwischen einer intrazellulären pH-Wert-Beeinflussung und einer veränderten proteolytischen Spaltung von APP durch Hyperforin besteht. Hyperforin zeigte einen deutlichen Einfluss auf die APP-Prozessierung, es erhöhte konzentrationsabhängig die Alpha-Sekretase-Spaltung, die Spaltung, die die Bildung des Alzheimer-relevanten A-Beta-Peptides verhindert. Da kein sAPP-Beta-spezifischer AK zur Verfügung stand, kann zu diesem Zeitpunkt nicht ausgeschlossen werden, dass auch die Beta-Sekretase-Spaltung durch Hyperforin beeinflusst wurde. Da die in dieser Arbeit verwendeten PC12 Zell-Linien nicht die abnorme hohe APP-Überproduktion wie andere Zell-Linien zeigen, war die Menge des in der kurzen Behandlungsdauer von 2-4 Stunden gebildeten A-Beta zu gering, um im ELISA erfasst zu werden. Die Tatsache, dass A-Beta unter den gegebenen Versuchsbedingungen durch ELISA nicht nachweisbar war, lässt eine stark erhöhte A-Beta-Produktion durch Hyperforin jedoch unwahrscheinlich erscheinen. Dadurch ist zum jetzigen Zeitpunkt auch der Einfluss der sw-Mutation auf die Hyperforin-Effekte noch unklar. Die Tatsache, dass Alpha- und Beta-Sekretasen in verschiedenen Kompartimenten aktiv sind und über verschiedenen Mechanismen aktiviert werden (vgl. Abschnitte 1.2.1.1 und 1.2.1.2), dass die Alpha-Sekretase-Spaltung bereits 90% der APP-Spaltung ausmacht und diese durch Hyperforin noch gesteigert wurde, wobei gleichzeitig intrazelluläres APP erniedrigt wurde (so dass die vermehrte Spaltung nicht auf ein erhöhtes Substratangebot zurückgeführt werden kann), lässt aber eine gleichzeitige Aktivierung von Alpha- und Beta-Sekretase unwahrscheinlich erscheinen. Vergleichende Untersuchungen mit FCCP und Bafilomycin A1 ergaben, dass für die Verschiebung der proteolytischen Prozessierung von APP weder die intrazelluläre pH-Wert-Erniedrigung, noch ein möglicher Einfluss auf Endosomen und Lysosomen, als Hauptursache in Frage kommt. Ein Vergleich mit PMA, das die Alpha-Sekretase durch eine direkte PKC-Aktivierung stimuliert, zeigte, dass Hyperforin auch keinen Phorbolester-ähnlichen Wirkungsmechanismus haben kann. Allerdings sieht es nach einigen Vorversuchen (SK&F, BAPTA/AM, Staurosporin, PKC-down Regulation Versuchen) so aus, als ob durch Hyperforin erhöhtes intrazelluläres Kalzium und/oder aktivierte PKC-Isoenzyme bei der Spaltung des intrazellulären APP und damit bei der Erhöhung der löslichen Spaltprodukte involviert ist/sind. Kalzium kann auch unabhängig von PKC die Alpha-Sekretase aktivieren (Buxbaum et al., 1994). Es aktiviert ERKs (Luo et al., 1997; Rosen et al., 1994; Rusanesco et al., 1995; Zhu et al., 2002), wobei aktivierte ERKs in der Lage sind, die Alpha-Sekretase zu stimulieren (Mills et al., 1997). Auch FCCP erhöht intrazelluläres Kalzium (Friel and Tsien, 1994; Luo et al., 1997; Park et al., 2002; Jensen and Rehder, 1991), wodurch es in PC12 Zellen zu einer Aktivierung von ERK1 und 2 kommen kann (Luo et al., 1997). Es muss aber bedacht werden, dass Hyperforin und FCCP unterschiedlich starke Effekte auf intrazelluläres APP und sAPP zeigten, so dass auch Mechanismen in Betracht gezogen werden müssen, bei denen Hyperforin anders als FCCP agiert. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Beeinflussung der Membranfluidität durch Hyperforin (Eckert and Müller, 2001) einen Einfluss auf die APP-Spaltung hat, da Veränderungen des Membrancholesterol-Gehaltes den Gehalt an sAPP und ABeta ändern, z.B. erniedrigt ein erhöhter Membran-Cholesterol-Gehalt sAPPAlpha (Bodovitz und Klein 1996, Racchi et al., 1998) und erhöht ABeta (Gouras et al., 2000). Eine Behandlung von Zellen, die zu einer Verringerung von intrazellulärem Cholesterol führt (Statine bzw. Cyclodextrin), reduziert die Spaltung von APP zu ABeta und erhöht sAPPAlpha (Fassbender et al., 2001; Kojro et al., 2001; Refolo et al., 2001).
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Mechanismen der zentralen Neuroprotektion von Statinen
(2007)
- Ziel dieser Arbeit war es, zentrale Wirkungen von Statinen näher zu untersuchen. Hierbei sollten zum einen die Statin-Effekte auf die zerebrale und membranäre Cholesterinhomöostase näher untersucht werden, zum anderen sollten Effekte von Statinen auf die APP-Prozessierung sowie auf apoptotische Regulatoren im Gehirn in vivo analysiert werden. Einfluss unterschiedlicher Applikationsformen auf zentrale Statin-Effekte Bislang ist noch nicht vollständig aufgeklärt, ob und inwieweit Statine die zerebrale Cholesterin- oder Isoprenoidsynthese beeinflussen. Statine werden in tierexperimentellen in vivo-Studien bei oraler Wirkstoffapplikation über unterschiedliche Applikationsformen verabreicht wie Schlundsondierung, über das Trinkwasser oder das Futter – der Einfluss der unterschiedlichen Applikationsformen auf die zentralen Statineffekte ist allerdings nicht bekannt. Die zerebralen Statinkonzentrationen wurden bislang nur nach Applikation per Schlundsonde im Tiermodell bestimmt. Für alle anderen oralen Applikationsformen liegen keine Konzentrations-Zeit-Profile der zerebralen Statinspiegel vor. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten über einen direkten Vergleich der Applikation von Lovastatin und Pravastatin über das Futter und per Schlundsonde zeigen, dass zentrale Statin-Effekte insbesondere auf membranärer Ebene entscheidend durch die Wahl der Applikationsform beeinflusst werden. Effekte von Simvastatin auf die zerebrale Cholesterinhomöostase – Vergleich Maus – Meerschweinchen In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von Simvastatin auf die zentrale und periphere Cholesterinhomöostase in zwei verschiedenen in vivo-Modellen, Mäusen und Meerschweinchen, untersucht. Sowohl Mäuse wie auch Meerschweinchen stellen etablierte Tiermodelle für Untersuchungen des Cholesterin- und Lipoprotein-Metabolismus dar. Allerdings weisen Meerschweinchen eine grössere Ähnlichkeit zum Menschen im Bezug auf den Lipidstoffwechsel auf als die Maus. Die auffälligste Übereinstimmung zwischen Mensch und Meerschweinchen ist, dass auch bei Meerschweinchen die Mehrheit des Cholesterins in LDL transportiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass insgesamt eine subchronische Simvastatin-Behandlung in Mäusen und Meerschweinchen nicht die gleichen Effekte auf die periphere und zentrale Cholesterinhomöostase hat. Allerdings belegen die Ergebnisse an beiden Tiermodellen, dass generell eine subchronische Simvastatin-Gabe die zerebrale Cholesterinhomöostase nicht negativ beeinflusst. Allerdings werden insbesondere die Serumcholesterinspiegel, die Cholesterinkonzentration in synaptosomalen Plasmamembranen und die DPH-Anisotropie in den beiden Tiermodellen vermutlich aufgrund von Speziesunterschieden im Lipidstoffwechsel in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst, so dass Speziesunterschiede bei der Interpretation tierexperimentellen Statin-Studien immer beachtet werden sollten. Effekte von Simvastatin auf die APP-Prozessierung in vivo Es ist bekannt, dass Statine einen unmittelbaren Einfluss auf die membranäre Cholesterinhomöostase ausüben und dabei vermutlich über eine Veränderung von Raft-Strukturen die APP-Prozessierung modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer subchronischen Simvastatin-Gabe auf die APP-Prozessierung in einem transgenen AD-Mausmodell (APP751SL-Mäuse) untersucht. Durch die Simvastatin-Behandlung wird eine Umverteilung des Cholesterins aus dem cytofacialen Membranblatt ins exofaciale Membranblatt in synaptosomalen Plasmamembranen induziert und die Proteinexpression des Raft-Markers Flotillin wird signifikant reduziert. Diese Veränderungen innerhalb der synaptosomalen Plasmamembranen sind mit einer Zunahme der Spiegel von unlöslichem Abeta im Gehirn der APP751SL-Mäuse assoziiert. Vermutlich war die Cholesterinsenkung in der Membran nicht stark genug, um die an der APP-Prozessierung beteiligten Sekretasen per se zu inaktivieren. Es scheint vielmehr zu einer Dislokalisation der Rafts zu kommen, die über eine räumliche Annäherung von APP und β-Sekretase/γ-Sekretase letztendlich zu einer erhöhten APP-Prozessierung führt. Darüberhinaus ist in unserer Studie eine Abnahme der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Gehirn der Simvastatin behandelten APP751SL-Mäuse nachweisbar sowie eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Plasma. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Clearance von zerebralem löslichem Abeta1-40 ins Blut durch Simvastatin erhöht wurde. Neuroprotektive Effekte von Simvastatin Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass Statine neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung zentrale protektive Effekte im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer Demenz (AD) oder ischämischem Schlaganfall vermitteln. In einer vorangehenden Studie an Mäusen konnten wir zeigen, dass eine subchronische Simvastatin-Gabe eine erhöhte Genexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 induziert. In der vorliegenden Arbeit kann dieser Befund im Gehirn von Meerschweinchen bestätigt werden und darüberhinaus kann nachgewiesen werden, dass Simvastatin eine Reduktion der Proteinexpression des proapoptotischen Proteins Bax im Gehirn der behandelten Meerschweinchen induziert. An dissoziierten Hirnzellen wurde anschließend untersucht, ob die signifikante Reduktion der Ratio Bax/Bcl-2 durch Simvastatin-Gabe im Gehirn von Meerschweinchen auf mitochondrialer Ebene protektiv wirkt gegen oxidativen und nitrosativen Stress sowie gegen den Bcl-2 Antagonisten HA 14-1. An dissoziierten Hirnzellen der behandelten Meerschweinchen wirkt Simvastatin über eine Senkung der Ratio Bax/Bcl-2, nachfolgende Hemmung der Caspase-Aktivierung und eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials protektiv. Diese protektiven Wirkungen von Simvastatin sind im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie der AD und dem ischämischem Schlaganfall von großer Bedeutung, da bei diesen Erkrankungen Apoptose und mitochondriale Dysfunktion eine Schlüsselrolle in neurodegenerativen Prozessen spielt.
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Mechanisms of apoptotic cell death of lymphocytes in aging and in Alzheimer's disease
(2001)
- Aging and age-related diseases are becoming more and more important for our society and our health care system. Alzheimer's disease (AD) is a disorder that destroys some parts of the brain and is characterized by global cognitive decline including a progressive irreversible loss of memory, orientation, and reasoning. “Healthy aging”, therefore, is one of the major aims for modern medicine. Apoptosis, or programmed cell death, plays an important role for example in fetal development, as well as for learning processes. T-lymphocytes usually undergo apoptosis in order to terminate an acute inflammation. The aim of this thesis was to explore the changes in the apoptotic mechanism of peripheral lymphocytes from Alzheimer’s disease (AD) patients in contrast to physiological aging. The experiments were conducted with lymphocytes of healthy volunteers of different ages, AD patients and young and aged mice. Moreover, transgenic mice carrying familiar AD-related mutations were examined. The aging study of peripheral cells of ‘healthy’-aged volunteers revealed an age-related increase of basal apoptosis. In addition, spontaneous apoptosis as well as apoptosis induced by oxidative stress (ROS) or by Fas engagement were enhanced in aging. A closer look at the subcellular basis of the lymphocytes (e.g. B-, NK-, CD4+-, and CD8+-T cells) determined that all lymphocyte subsets were affected by aging. Therefore, it could be concluded that the regulation of apoptosis is generally impaired in lymphocytes of aged persons. The increased susceptibility to oxidative stress supports the ‘Free radical theory of aging’ that claims the radicals to be the cause for the aging-process. In mice an increase of basal, spontaneous and ROS-induced apoptosis was detected in T cells from the spleen, as well. An oral treatment over two weeks with the Ginkgo biloba extract EGb761 showed a clear reduction of ROS-induced apoptosis in the treated group. Interestingly, basal and spontaneous apoptosis, e.g. physiological apoptosis, were not effected by the plant extract. This is an important benefit for therapy since physiological apoptosis has a great relevance in the elimination of cancer-cells for example. In conclusion, the antidementive drug EGb761 reduces specifically ROS-induced apoptosis that a plays an important role in aging as shown in this thesis. Based on the data found in healthy aging, lymphocytes from AD patients were assessed for apoptosis. The cells show enhanced levels of basal, spontaneous, and Fas-induced apoptosis. In subsequent experiments it was demonstrated that mainly the T cells were responsible for the findings. However, the NK-cells provided an important impact as well. In concordance with AD-affected neurons, peripheral lymphocytes of AD patients show clear signs of apoptotic cell death. In addition, basal apoptosis of T cells and the CD4/CD8-ratio showed a correlation with the severity of the dementia. Therefore, it could be speculated that apoptosis is due to activation-induced cell death (AICD) that occurs in acute and chronic activation of adaptive immunity. In AD there is a chronic neuroinflammation in the CNS triggering degeneration of neural tissue. In order to explore this, the experimental model of lymphocyte’s activation was established in healthy aging first. The study included the detection of various events of lymphocyte’s activation on the basis of the T cell subsets (CD4+ and CD8+). The inducibility to mitogenic stimulation clearly decreased in both subsets in aging. In contrast, T lymphocytes from AD patients showed an enhanced activation subsequent to mitogenic stimulation compared with age-matched nondemented persons. Only proliferation of CD8+ T cells was clearly reduced in AD. This data could be clues that an increased generation of memory T cells due to chronic neuroinflammation might be evident in AD. Memory T lymphocytes show increased inducibility upon mitogenic activation. Interestingly, CD8+ memory T cells display decreased prolifertive capacity. Due to activation, cells die by apoptosis later on. It could be concluded that AD patients display an increased amount of memory T cells compared to controls. The data implicate that there could be a cross talk between inflammatory within the brain and inflammatory cells of the periphery. This is an interesting point since the brain used to be assumed as immune-privileged zone. According to the experiment, the information of the diseased brain is transferred to white blood cells. The connection of those two compartments might raise the opportunity to observe and probably to influence easily not-accessible regions like the brain. Transgenic mice carrying mutations in familiar AD-relevant genes (Amyloid-Precursor-Protein, Presenilin-1, respectively) displayed enhanced levels of apoptotic T cells from the spleen, as well. It seems that those mutated proteins influence the regulation of apoptosis. Probably, they are involved in the increased cell death of T- and NK-cells, as well. Animals overexpressing Presenilin-1 showed reduced levels of apoptotic cell death. It was demonstrated with molecuar biology tools that Presenilin-1, processed during apoptosis, has an anti-apoptotic effect.
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Vergleichbarkeit von Phytopharmaka am Beispiel Ginkgo-biloba-haltiger Produkte des US-amerikanischen Marktes
(2001)
- Aufgrund der zunehmenden Marktbedeutung und der Fülle pflanzlicher Präparate in Europa und den USA stellte sich die Frage, ob - im Sinne des Patienten und rationaler Phytotherapie - eine ausreichende Qualität der Produkte deren Einsatz rechtfertigt. Die Qualität pflanzlicher Produkte ist aufgrund der Besonderheit eines Vielstoff-Gemisches mit oftmals unbekannten wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen schwer zu beurteilen. In Europa sind deshalb schon vor Jahren Bestrebungen angestellt worden, pflanzliche Produkte aufgrund von Monographien (Kommission E) zumindest in ihren Ausgangsdrogen und ihrer Extraktspezifikation zu vereinheitlichen. Normierung und Standardisierung von Extrakten wurden gefordert. Während der Diskussion über die Qualität der Extrakte (Normierung/Standardisierung) ist dabei ein wesentlicher Aspekt hinsichtlich der Vergleichbarkeit von Qualität und Wirksamkeit von Fertigprodukten verloren gegangen: der Einfluß der Arzneistoff-Formulierung auf die in vivo-Situation. Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption des enthaltenen Pharmakons (Bioverfügbarkeit) können sowohl von den physiko-chemischen Wirkstoffeigenschaften, wie Löslichkeit und Permeabilität, als auch von Eigenschaften der Darreichungsform abhängen. Entscheidend ist, welcher Prozeß für die Resorption in den Organismus der geschwindigkeitsbestimmende ist: die Freisetzung des Wirkstoffes aus der Darreichungsform oder der Permeationsprozeß durch die Darmmembran. Ist letzterer der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, so sind gewisse Veränderungen der Wirkstofffreisetzung ohne Belang. Das Vergleichen von Extraktqualitäten (Wirkstoffen), wie es durch die Kommission E-Monographie vorgeschlagen wird, ist folglich nicht ausreichend. Einflüsse der Darreichungsform (biopharmazeutische Eigenschaften) sind zu berücksichtigen. Wie bei chemisch-synthetischen Wirkstoffen sollte therapeutische Vergleichbarkeit über Bioäquivalenz-Studien belegt werden. Als bioäquivalent gelten zwei Produkte, wenn sie pharmazeutisch äquivalent sind und wenn ihre Bioverfügbarkeiten bei Gabe gleicher Dosen so ähnlich sind, daß die erzielten Effekte bezüglich Wirksamkeit und Sicherheit praktisch identisch sind. Das Problem des Belegs der pharmazeutischen Äquivalenz (gleiche Mengen gleicher Wirkstoffe in gleicher oder ähnlicher Darreichungsform) bei pflanzlichen Produkten ergibt sich aus der Tatsache, daß sie sich phytochemisch als Vielkomponenten-Gemische nur schwer charakterisieren lassen. Wirksamkeitsbestimmende Substanzen sind häufig nicht bekannt. Die Kenntnis wirksamkeitsmitbestimmender Komponenten ermöglicht nur einen partiellen Beleg der Äquivalenz, und pharmakologisch irrelevante Leitsubstanzen können höchstens Zwecken der Standardisierung dienen. Vergleichende Bioverfügbarkeitsuntersuchungen im Sinne von Analysen einzelner Bestandteile in Körperflüssigkeiten sind nur möglich, wenn die wirksamkeitsbestimmenden Komponenten des pflanzlichen Produktes bekannt sind. Alternativ werden Bestimmungen der Bioverfügbarkeit im Form pharmakodynamischer Ansätze diskutiert. Durch die Bestimmung pharmakodynamischer Parameter soll dabei die Aufnahme und Ausscheidung des gesamten „wirksamen Prinzips“ des pflanzlichen Produktes in den Organismus verfolgt werden. Voraussetzung ist natürlich, daß der untersuchte Effekt graduell quantifizierbar ist, in seiner Ausprägung eine Beschreibung von Ausmaß und Geschwindigkeit der Resorption erlaubt und vor allem mit der klinischen Wirksamkeit des betreffenden Produktes korreliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ginkgo biloba-haltige Fertigprodukte des US-amerikanischen Marktes hinsichtlich ihrer therapeutischen Vergleichbarkeit untersucht. Für Ginkgo biloba-Extrakte sind wirksamkeitsmitbestimmende Komponenten benannt worden: Flavonglykoside und Terpenlaktone. Anhand derer wurden Untersuchungen zur pharmazeutischen Qualität der Ginkgo-Präparate durchgeführt. Hinsichtlich der Gehalte an Flavonglykosiden und Terpenlaktonen ergaben sich beachtliche Unterschiede. Als Maßstab wurde die Spezifikation der Kommission E angelegt; viele der untersuchten Extrakte lagen signifikant außerhalb der vorgegebenen Spannen, andere wiederum erfüllten diese Anforderungen. Auch die Begleitstoffmuster und -gehalte der diversen Extrakte unterschieden sich deutlich voneinander. Als Beispiel seien hier die Ginkgolsäure-Gehalte angeführt, deren Spanne von < 5 ppm bis 90.000 ppm reichte. Die untersuchten Extrakte konnten also schon aufgrund der Gehalte an wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffen in der Mehrzahl nicht als miteinander pharmazeutisch äquivalent angesehen werden. Zusätzlich ergaben Untersuchungen zu biopharmazeutischen Qualitäten (in vitro-Freisetzungsverhalten) einiger Produkte deutliche Unterschiede. Da auch für Ginkgo biloba-Extrakt nicht alle wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe bekannt sind, wäre es wünschenswert gewesen, die Produkte in einem pharmakodynamischen Ansatz hinsichtlich ihrer Bioverfügbarkeiten miteinander vergleichen zu können. Allerdings konnte im Rahmen dieser Arbeit kein in vitro-Modell gefunden werden, welches sich als sensitiv genug und als potentieller Bioassay geeignet erwiesen hätte. Deshalb wurde wenigstens eine vergleichende Bioverfügbarkeitsstudie zweier Präparate – im klassischen Sinne - durch Analyse einiger wirksamkeitsmitbestimmender Substanzen (Ginkgolid A, B und Bilobalid) in Körperflüssigkeiten (Blut) durchgeführt. Zwei Produkte mit stark differierendem Freisetzungsverhalten wurden gegeneinander verglichen. Die Studie ergab einen signifikanten Einfluß der Darreichungsform auf die Bioverfügbarkeit und letztendlich Bioinäquivalenz der untersuchten Produkte. Die vorliegende Arbeit zeigt, wie relevant die pharmazeutische Qualität der Produkte, inklusive ihrer biopharmazeutischen Eigenschaften, für die therapeutische Austauschbarkeit von Produkten sein kann. Auf dem Sektor pflanzlicher Produkte sind bis dato sehr wenige Untersuchungen hinsichtlich des Einflusses der Darreichungsform auf in vivo-Verhältnisse und der Bioverfügbarkeit durchgeführt worden. Des weiteren fehlen Kenntnisse zu wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffen oder alternativ pharmakodynamische Modelle, die eine Bestimmung der Bioverfügbarkeit ohne Kenntnis der pharmakologisch relevanten Inhaltsstoffe ermöglichen.
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Untersuchungen zur Interaktion des Alzheimer Demenz : assoziierten Proteins Presenilin 1 mit dem Cytoskelett
(2001)
- Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Wechselwirkung des AD-assoziierten Proteins PS1 mit dem Cytoskelett in verschiedenen biochemischen und immuncytochemischen Modellen zu untersuchen. Auf diese Weise sollten Hinweise für das Verständnis der bisher nur in Grundzügen bekannten physiologischen Funktion von PS1 erhalten werden. Ausgehend vom Nachweis der Anreicherung endoproteolytischer PSI-Fragmente in Cytoskelett-Fraktionen aus Hirngewebe wurde die spezifische Assoziation des Proteins mit Mikrofilamenten, Mikrotubuli und Neurofilamenten untersucht. Alle durchgeführten biochemischen und immuncytochemischen Experimente zeigen übereinstimmend die spezifische Assoziation von PS1 mit Mikrofilamenten. So konnten PSI-Fragmente über zwei Depolymerisations/ Polymerisations-Zyklen zusammen mit Actin aus Rattenhirn aufgereinigt werden. Die spezifische Spaltung von Actin-Filamenten durch Gelsolin in cytoskelettreichen Fraktionen aus Hirngewebe führte zur Freisetzung kürzerer Filamente, die nach Zentrifugation zusammen mit PS1- Fragmenten im Überstand erschienen. In immuncytochemischen Färbungen kolokalisierte PS1 mit Actin-Filamenten in primären Gliazellen und der neuronalen Zelinie NT2. Eine vor kurzem veröffentlichte Arbeit zeigte außerdem die Kolokalisation von PS1 und Mikrofdamenten in primären Hippocampus-Neuronen. Die fehlende Kosedimentation von in-vitro translatiertem PS1 und Deletionskonstrukten von PS1 mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Actin-Filamenten, das Fehlen konservierter Actin-Bindungsmotive in der Aminosäuresequenz von PS1 sowie bekannte Interaktionen von PS1 mit Actin-bindenden Vertretern der Filamin- und Armadillo-Proteinfamilien lassen auf eine indirekte Assoziation von PS1 mit Mikrofdamenten schließen. Die vorliegende Arbeit konnte die Frage, welche Rolle Mikrotuli oder Neurofilamente bei der Cytoskelett-Assoziation von PS1 spielen, nicht abschließend Mären. PS1-Fragemente wurden im ersten, nicht jedoch im zweiten Depolymerisations/Polymerisations-Zyklus zusammen mit Tubulin aus Rattenhirn aufgereinigt. In dem gleichen Versuchsansatz kosedimentierte in-vitro translatiertes PS1 nicht mit Mikrotubuli. Immuncytochemische Färbungen zeigten dagegen die Kolokalisation von PS1 mit Mikrotubuli in primären Hippocampus-Neuronen, die auch von zwei aktuellen Arbeiten in primären Hippocampus-Neuronen und murinen Embryonen bestätigt wurde. Die spezifische Depolymerisation von Mikrotubuli in cytoskelettreichen Fraktionen war unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bedingungen nicht erfolgreich, so daß aus diesem Experiment keine Aussagen zur Assoziation von PS1 mit Mikrotubuli abgeleitet werden konnten. Es Iäßt sich die Hypothese aufstellen, daß sehr kleine PSI-haltige Vesikel über andere Proteine als PS1 mit Mikrotubuli verbunden sind, so daß PS1 mit Mikrotubuli scheinbar kolokalisiert ist. Hochauflösenden lichtmikroskopische bzw. elektronenmikroskopische Aufnahmen oder biochemische Versuche, die nicht zur Zerstörung der Vesikel durch Detergens führen, könnten für die Überprüfung dieser Hypothese herangezogen werden. In-vitro translatiertes PS1 sowie Deletionskonstrukte von PS1 kosedimentierten nicht mit aufgereinigten und in-vitro assemblierten Neurofilamenten, und in primären Hippocampus-Neuronen kolokalisierte PS1 nicht mit Neurofilamenten. Es wäre jedoch wünschenswert, die Experimente mit geeigneten Positiv-Kontrollen für die Kosedimentation und geeigneteren Antikörpern, die bei einem besseren Signal/Hintergrund-Verhältnis eine stärkere Vergrößerung der Immunfluoreszenzen erlauben, zu wiederholen. Im transgenen Tiermodell beeinträchtigten pathogene Mutationen von PS1 nicht, zumindest nicht quantitativ, die Fähigkeit von PS1, an Cytoskelett-Elemente zu binden. Es wäre jedoch möglich, daß es Unterschiede in der Cytoskelett-Assoziation von wt PS1 und PS1 mit pathogenen Mutationen gibt, die nur im Gewebe von FAD-Patienten zu detektieren sind, nicht aber im transgenen Tiermodell, da die bisher bekannten AD-Tiermodelle nicht alle Aspekte der Erkrankung reproduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse können die Basis bilden für weitergehende Untersuchungen zur Funktion von PS1 und der Bedeutung von PS1-Cytoskelettinteraktionen in der Alzheimer Demenz. Aktuelle Arbeiten fokussieren dabei stark auf die Interaktion von PS1 mit Mikrofilament-bindenden Vertretern der Armadillo-Proteinfamilie, die bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen eine wichtige Rolle spielen. Im Diskussionsteil wurde ausgeführt, daß aber, gerade im Hinblick auf die Neurodegeneration bei der Alzheimer Demenz, ein möglicher Einfluß von PS1 auf den schnellen axonalen Transport ein interessanter Ansatz für weitere Versuche sein kann.
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Effekte von Johanniskrautextrakt und anderen Antidepressiva auf die Funktion und Expression von P-Glykoprotein sowie die Plasma-Hirn-Verteilung von Corticosteron
(2005)
- Es wurden Antidepressiva verschiedener Klassen bezüglich ihrer Hemmung von Pgp in zwei Zellsystemen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Calcein-AM) untersucht. Die untersuchten Substanzen zeigen alle in höheren Konzentrationen eine Hemmung von Pgp. Da diese Konzentrationen nach Applikation therapeutisch relevanter Dosen in-vivo nicht erreicht werden, lässt sich die These, dass ein Teil der antidepressiven Wirkung dieser Substanzen durch Normalisierung der HPA-Achse zu Stande kommt, durch die Ergebnisse dieser Arbeit nicht bestätigen. Weiterhin sollte untersucht werden, ob die Hemmung von Pgp eine Eigenschaft ist, die Antidepressiva von anderen zentral-wirksamen Substanzklassen unterscheidet. Ausgehend von der Annahme, dass die Hemmung von Pgp zur antidepressiven Wirksamkeit beiträgt, wäre die Schlussfolgerung naheliegend, dass andere Gruppen, wie z.B. Antipsychotika diese Eigenschaft nicht aufweisen. Daher wurden drei verschiedene Antipsychotika bezüglich der Modulation der Aktivität von Pgp im Calcein-AM Assay untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Antipsychotika ebenfalls Pgp in höheren Konzentrationen – ähnlich der hemmenden Konzentrationen von Antidepressiva - inhibieren. Von daher ist die Hemmung von Pgp keine substanzklassenabhängige Eigenschaft der Antidepressiva, sondern eher eine unspezifische Eigenschaft, die verschiedene ZNS-wirksame Wirkstoffklassen aufweisen. Des Weiteren wurde die Modulation der Expression von Pgp durch Antidepressiva untersucht. Denn beide Veränderungen, zum einen bezüglich der Aktivität von Pgp und zum anderen bezüglich der Expression von Pgp, können zu klinisch relevanten Arzneimittelinteraktionen führen. Der Hauptuntersuchungsgegenstand dieser Arbeit ist Johanniskrautextrakt, daher wurde in-vitro der Extrakt selbst und die aus dem Calcein-Assay als potenteste Modulatoren anzusehenden Inhaltsstoffe bezüglich der Expression untersucht. Es konnte eindeutig gezeigt werden, dass der Extrakt selbst und auch Hyperforin die Expression von Pgp induzieren. Die Induktion durch Hyperforin entspricht der durch den Gesamtextrakt, so dass man sagen kann, dass Hyperforin der Inhaltsstoff von Johanniskrautextrakt ist, der die Expression von Pgp induziert. Diese Wirkung kommt über eine Aktivierung des PXR zu Stande, der seinerseits die Expression von Pgp moduliert. Hyperforin ist als starker PXR Ligand charakterisiert. Die Induktion konnte ebenfalls im Gehirn von Mäusen nach 14tägiger oraler Applikation von Johanniskrautextrakt gesehen werden. Für die Versuche bezüglich der Expression von Pgp im Gehirn von Mäusen und für das nächste Untersuchungsziel, die Untersuchung der Verteilung von Corticosteron in Mäusen, wurden Behandlungsstudien durchgeführt. Es wurden männliche, 2-3 Monate alte NMRI-Mäuse oral durch Schlundsondierung mit den entsprechenden Substanzen behandelt. Es wurden akute (einmalige Applikation und Tötung der Tiere 1h später) und subchronische (14tägige Applikation, Tötung an Tag 15) Studien durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob Antidepressiva die Verteilung von Glucocorticoiden im Körper (Gehirn/Plasma) modulieren können. Diesbezüglich wurde der Effekt von Johanniskrautextrakt, Mirtazapin, Amitriptylin und Fluoxetin nach akuter Einmalgabe und nach subchronischer 14tägiger oraler Applikation der Substanzen untersucht. Amitriptylin zeigt keinen Effekt auf die Konzentration und/oder Verteilung von Corticosteron, weder nach akuter noch nach subchronischer Gabe. Fluoxetin erhöht die Corticosteronlevel in Gehirn und Plasma sowohl nach Einmalgabe als auch nach subchronischer Applikation signifikant. Mirtazapin erhöht akut ebenfalls Corticosteron in Gehirn und Plasma, nach subchronischer Applikation nivelliert sich dieser Effekt jedoch wieder. Nach 14tägiger Gabe ist kein signifikanter Unterschied mehr zur Kontrolle zu erkennen. Johanniskrautextrakt verhält sich ähnlich wie Fluoxetin. Es erhöht im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Corticosteron in Plasma und Gehirn sowohl nach akuter als auch nach subchronischer Applikation. Keine der untersuchten Substanzen verschiebt die Verteilung von Corticosteron zwischen Gehirn und Plasma im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Konzentration von Corticosteron im Körper wird über 5-HT2 Rezeptoren gesteuert. Indirekte Agonisten wie Fluoxetin und Johanniskrautextrakt erhöhen sie, Antagonisten wie Mirtazapin und Amitriptylin verändern sie nicht. Zusammenfassend kann man bezüglich des Hauptuntersuchungsgegenstandes Johanniskrautextrakt sagen, dass der Extrakt selbst, Hyperforin und Quercetin in der Lage sind, die Transportaktivität von Pgp konzentrationsabhängig zu modulieren. Nach längerer Inkubation induziert der Extrakt durch die Wirkung von Hyperforin als PXR-Aktivator die Expression von Pgp. Darüber hinaus verändert Johanniskrautextrakt die Corticosteronausschüttung bei Mäusen, die oral mit dem Extrakt behandelt wurden, ohne die Verteilung zwischen Gehirn und Plasma zu verändern.
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Untersuchung zu neuroprotektiven Effekten mediterraner Pflanzenextrakte auf oxidative Stress-Parameter in vitro und in vivo
(2005)
- Das Ziel dieser Arbeit war es, die möglichen positiven Effekte mediterraner Pflanzenextrakte auf oxidative Stress-Parameter im Gehirn zu untersuchen. Die Extrakte wurden im Rahmen eines EU-Projektes durch in vitro-Screenings aus einer Vielzahl, in Italien, Griechenland und Spanien gesammelten nicht-kulivierten Pflanzen, ausgesucht und hinsichtlich ihres Potentials verschiedene antioxidative Faktoren zu beeinflussen in einem in vivo-Mausmodell geprüft. Insgesamt sind 127 Pflanzen, die von der lokalen Bevölkerung mediterraner Länder traditionell verzehrt werden in 12 in vitro-Test untersucht worden. Darunter waren radikal- und Enzym-beeinflussende Tests und Versuchsansätze um antikanzerogene oder DNA-schädigende Eigenschaften zu überprüfen. Nach Auswahl von 12 potentiellen Extrakten für die Fütterungsexperimente, wurden auf Grund von weiteren Screenig-Tests wie z.B. das Potential der Extrakte eine Rigidisierung der Membranen oder Lipidperoxidation zu verhindern, die möglichen Kandidaten für die in vivo-Versuche weiter eingegrenzt. Zur Auswahl der drei Extrakte Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella kam es letztendlich durch die guten Ergebnisse in den Vorversuchen und durch den Ausschluss von ebenfalls positiven Extrakten, die toxische Eigenschaften im MTT-Test gezeigt hatten. Zur in vivo-Untersuchung der drei Extrakte wurden weibliche NMRI-Mäuse für drei Monate mit jeweils einem der Pflanzenextrakte gefüttert. Danach wurden sämtliche Parameter in jungen (6 Monate) und alten (21 Monate) NMRI-Mäusen untersucht, um altersbedingte Unterschiede hinsichtlich der Wirkung der Extrakte festzustellen. Zusammenfassend zeigen unsere Untersuchungen an Hirnhomogenaten und dissoziierten Neuronen von NMRI-Mäusen, dass es mit zunehmendem Alter zur Aktivierung verschiedener antioxidativer Abwehrmechanismen kommt. Diese dienen dazu ROS-Level auf einem möglichst unschädlichen Niveau zu halten. Hier spielen vor allem die erhöhten Enzym-Aktivitäten eine wichtige Rolle, die die reaktiven Spezies zu einem relativ frühen Zeitpunkt abfangen und so z.B. eine vermehrte Schädigung der Lipidmoleküle verhindern. Bei den in Fütterungsexperimenten untersuchten Extrakten handelte es sich um die mit Ethanol extrahierten Inhaltsstoffe aus den Pflanzen (Reichardia picroides, Urospermum picroides und Thymus piperella). Die drei Extrakte wiesen variierende Polyphenolgehalte und eine unterschiedliche Zusammensetzung ihre Inhaltsstoffe, die Flavonoide betreffend auf. Alle drei Pflanzenextrakte zeigten unterschiedlich starke Effekte auf die gemessenen Parameter und machten deutlich wie wenig eine positive Wirkweise von pflanzlicher Ernährung verallgemeinert werden kann. Die besten Ergebnisse zeigte dabei der Reichardia-Extrakt.
