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Verbesserung des Auflösungsverhaltens von schwer löslichen schwachen Säuren durch feste Lösungen und Cyclodextrin-Komplexe (2010)

Thomas Zöller

In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt, mit denen das Auflösungsverhalten schwer wasserlöslicher schwacher Säuren verbessert werden kann. Als Modellwirkstoffe wurden drei Vertreter der Sulfonylharnstoff-Gruppe (Glibenclamid, Glipizid und Glimepirid) gewählt. Diese Wirkstoffe, werden zur oralen Standardtherapie des Typ 2 Diabetes eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Löslichkeits- und Freisetzungsuntersuchungen der reinen Arzneistoffe bildeten in dieser Arbeit den Ausgangspunkt der Entwicklungsarbeit. Um den Einfluss der galenischen Methoden auf das Freisetzungsverhalten der entwickelten Formulierungen besser zu beurteilen, wurden ebenfalls entsprechende Handelspräparate (Euglucon N 3,5 mg, Luditec 5 mg und Amaryl 4 mg) untersucht. Zunächst wurden mit Glibenclamid und dem natürlichen ?-CD sowie verschieden Cyclodextrin-Derivaten (M-?-CD und HP-?-CD) binäre Komplexe im molaren Verhältnis von 1:2 (Glibenclamid:CD) hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurden feste Lösungen aus Glibenclamid und Kollicoat(r) IR bzw. PVP K30 entwickelt. Bei den nachfolgenden Freisetzungsuntersuchungen zeichnete sich im Falle der binären Cyclodextrin-Komplexe ab, dass der Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex das beste Freisetzungsverhalten von Glibenclamid in den untersuchten Medien erreichte. Bei den festen Lösungen von Glibenclamid gab es zwischen den beiden untersuchten Polymeren keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Glibenclamidfreisetzung. Im nächsten Schritt wurden ternäre Komplexe (Glibenclamid-HP-?-CD-Polymer) entwickelt, eine Kombination aus binären CD- Komplexen und festen Lösungen. Als dritte Komponente wurden Kollicoat(r) IR, PVP K30 und PEG 6000 in unterschiedlichen Zusätzen, 5, 10 und 20% bezogen auf den zugrunde liegenden binären Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex eingearbeitet. Die Charakterisierung der verschiedenen ternären Komplexe ergab, dass das beste Freisetzungsverhalten bei den Komplexen, welche einen 10%igen Kollicoat(r) IR- bzw. 20%igen PVP K30-Zusatz enthielten, generiert werden konnte. Bei den drei verwendeten Methoden (binäre-, ternäre Komplexe und feste Lösungen) erhielt man während der Freisetzungsuntersuchungen in den Medien mit einem pH-Wert unterhalb des pKs-Wertes von Glibenclamid (5,4) eine übersättigte Wirkstofflösung, was zum Teil innerhalb kürzester Zeit zum Präzipitieren des Wirkstoffes führte. Initiale DSC-Untersuchungen hatten gezeigt, dass Glibenclamid in den beschriebenen Präformulierungen in amorpher Form vorlag, was der Grund für die rasche Freisetzung war. Anschließend wurde versucht, das Präzipitieren zu verlangsamen und im besten Fall zu verhindern. Hierfür wurde HPMC in verschiedenen Formen verwendet. Das einfache Hinzumischen von HPMC in eine Gelatine-Kapsel zu der Glibenclamid-Formulierung führte aufgrund von Agglomeratbildungen zu einer deutlichen Verzögerung der Wirkstofffreisetzung. Pankreatin als Zusatz zum Freisetzungsmedium konnte die Bildung eines Agglomerates nicht verhindern, was darauf schließen ließ, dass dieses nicht durch sogenanntes "Cross-linking" der Gelatine entstanden war. In einem nächsten Schritt wurden HPMC-Kapseln eingesetzt. Die Glibenclamidfreisetzung konnte durch einfaches Austauschen der Gelatine-Kapseln gegen Vcaps(r) Plus-Kapseln in allen untersuchten Medien deutlich gesteigert werden, was auf die durch die Anwesenheit von HPMC verzögerte Präzipitation des Wirkstoffes im Freisetzungsmedium zurückzuführen war. Im nächsten Schritt wurde, die Formulierungsmethode von Glibenclamid, auf Glipizid übertragen. Es wurde analog zu Glibenclamid ein binärer Glipizid-HP-?-CD-Komplex im molaren Verhältnis von 1:2 (Glipizid:HP-?-CD) hergestellt. Dieser Komplex führte zu einer deutlichen Verbesserung des Auflösungsverhaltens von Glipizid, was zu einer annähernd 100%igen Wirkstofffreisetzung in allen untersuchten Medien führte. Weiterhin wurden die mit Glibenclamid entwickelten Methoden auch auf Glimepirid übertragen. Die Formulierung von Glimepirid zu einem binären Glimepirid-HP-?-CD-Komplex führte zu einer höheren Wirkstofffreisetzung, verglichen mit der kristallinen Reinsubstanz und des Handelspräparates. Durch die Verarbeitung von Glimepirid in ternären Komplexen erhöhte sich das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung deutlich. Mit Kollicoat(r) IR konnte eine Wirkstofffreisetzung von ca. 60% der Dosis und mit PVP K30 als dritter Komponente sogar ca. 85% Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF erzielt werden. Das Präzipitieren des Wirkstoffes nach initialer Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF konnte durch den Einsatz von Vcaps(r) Plus-Kapseln deutlich reduziert werden. Stabilitätsuntersuchungen, welche mit den in dieser Arbeit verwendeten Präformulierungen durchgeführt wurden zeigten, dass der jeweilige Wirkstoff auch nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur und < 30% rel. Luftfeuchte, in amorpher Form in den entsprechenden Präformulierungen vorlag. All diese Untersuchungen zeigten eindrucksvoll, dass sich Cyclodextrin-Derivate in Kombination mit hydrophilen Polymeren, dazu eigneten, die Verfügbarkeit schwer löslicher Wirkstoffe im Dünndarm für deren Resorption zu verbessern. Es wurde gezeigt, dass die Herstellungsmethodik der Cyclodextrin-Komplexe einen wesentlichen Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung hatte.

Functional analysis of the ABC export systems TmrAB from Thermus thermophilus and MDL1 from Saccharomyces cerevisiae (2011)

Ariane Zutz

Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. Einige Vertreter der ABC Transporter weisen eine hohe klinische Relevanz auf, da sie an der Ausbildung verschiedenster Krankheitsbilder beteiligt sind. So beruht u.a. die Entstehung der zystischen Fibrose auf Mutationen des humanen CFTR‐Transporters. Die Fehlfunktion des mitochondrialen ABC‐Transporters ABCB7 hat die Entstehung der X‐chromosomalen sideroblastischen Anämie verbunden mit cerebraler Ataxie (XLSA/A) zur Folge. Weiterhin spielen ABC‐Transporter wie MDR1 (P‐gp) oder BCRP eine entscheidende Rolle bei der Ausscheidung von Chemotherapeutika, wodurch sie die Multidrug‐Resistenz von Krebszellen vermitteln. Auch bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen sind ABC‐Transporter von essentieller Bedeutung, da sie mitunter für die Ausbildung von Antibiotika‐Resistenzen verantwortlich zeichnen. Aufgrund dessen sind die Funktion und der Mechanismus von ABC‐Proteinen von zentraler Bedeutung in der klinischen und pharmazeutischen Forschung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden der prokaryotische ABC‐Komplex TmrAB aus Thermus thermophilus sowie der mitochondriale ABC‐Transporter MDL1 aus der Bäckerhefe als Modellsysteme gewählt, um neue Einblicke in die Funktionsweise und Substratspezifität von ABC‐Exportproteinen zu erhalten. Das Genom des Gram‐negativen Eubakteriums T. thermophilus kodiert ca. 46 unterschiedliche ABC‐Proteine, wobei nur TmrA (TTC0976) und TmrB (TTC0977) als ABCHalbtransporter identifiziert werden konnten. Da die offenen Leserahmen beider Gene überlappen, ist vorhergesagt, dass beide Untereinheiten gemeinsam transkribiert und translatiert werden und anschließend zu einem heterodimeren ABC‐Exportkomplex assemblieren. Homologievergleiche mit bekannten ABC‐Proteinen zeigen eine hohe Ähnlichkeit von TmrA und TmrB zu Mitgliedern der Multidrug‐Resistenz ABC‐Familie wie u.a. LmrCD aus Lactococcus lactis. Der heterodimere TmrAB‐Komplex weist die typische Domänenarchitektur von ABC‐Exportern auf, welche durch zwei Transmembrandomänen (TMDs) und zwei Nukleotidbindedomänen (NBDs) charakterisiert ist. Jede Untereinheit besteht hier aus einer TMD und einer NBD, die zu einem Polypeptid fusioniert sind. Die TMDs bestehen aus sechs putativen, in die Membran eingebetteten, alpha‐helikalen Domänen und bilden miteinander die Translokationspore für das entsprechende Substrat. Im Allgemeinen zeigen die TMDs der unterschiedlichen ABC‐Exporter nur eine sehr geringe Sequenzhomologie, wodurch die hohe Substratdiversität der Proteinfamilie gekennzeichnet ist. Die NBDs sind für die ATP‐Bindung und ‐Hydrolyse und somit für die Energetisierung des Transportprozesses verantwortlich. Im Gegensatz zu den TMDs besitzen die NBDs aller ABC‐Transporter eine hoch konservierte Aminosäuresequenz, was einen generellen Hydrolyse‐Mechanismus impliziert. Sie sind durch die konservierten Walker A‐ (P‐Loop) und Walker B‐Motive gekennzeichnet, welche die ATP‐Bindung und die Koordination des Mg2+‐Ions in der Bindetasche vermitteln. C‐terminal vom Walker B‐Motiv befindet sich ein Glutamat, das als katalytische Base fungiert und durch Koordination eines Wassermoleküls die Hydrolyse des ATPs bedingt. Im Fall von TmrB ist dieses Glutamat gegen ein Aspartat ausgetauscht, woraus eine nicht‐kanonische NBD resultiert. Bisher ist unklar, ob das Aspartat ebenfalls als katalytische Base fungieren kann. Zusätzliche Sequenzmotive, die in den NBDs zu finden sind, sind der Q‐, D‐ und H‐Loop sowie das ABC signature Motiv (C‐Loop), welches ABC‐Proteine als solche kennzeichnet. Der C‐Loop bildet eine Verbindung zum γ‐Phosphat des gebundenen Nukleotids der gegenüberliegenden NBD, was die Dimerisierung der beiden NBDs begünstigt. Jede NBD besteht aus zwei Domänen: der RecA‐ähnlichen, welche das Walker A‐ und Walker BMotiv sowie den Q‐ und den H‐Loop enthält, und einer helikalen Domäne, in der der C‐Loop lokalisiert ist. Die Bindung des Nukleotids bewirkt die Dimerisierung der beiden NBDs in einer head‐to‐tail Orientierung, wobei jeweils ein ATP zwischen dem Walker AMotiv des einen Monomers und dem C‐Loop des zweiten Monomers koordiniert wird. Die Dimerisierung der NBDs bedingt einen Konformationswechsel der TMDs, wodurch die Substrattranslokation vermittelt wird. Um die TMDs in ihre Ursprungsposition zurück zu setzen, ist die Hydrolyse der gebunden ATPs und vermutlich auch die Freisetzung der gebildeten ADP/Pi‐Moleküle erforderlich. Für ABC‐Exportproteine, welche aus zwei kanonischen, d.h. zwei funktional gleichwertigen NBDs bestehen, ist postuliert, dass beide Nukleotide entweder in einem alternierenden oder in einem sequentiellen Mechanismus hydrolysiert werden. Für asymmetrische ABC‐Proteine wie z.B. TmrAB oder LmrCD, welche in einer NBD degenerierte Sequenzmotive aufweisen, ist bisher nicht vollständig geklärt, ob die Hydrolyse beider Nukleotide erforderlich ist, um die Substrattranslokation zu vermitteln. Um einen besseren Einblick in den Mechanismus der ATP‐Hydrolyse von bakteriellen, asymmetrischen ABC‐Transportern zu erlangen, wurden TmrAB‐Varianten generiert, welche Mutationen in den beiden putativen katalytischen Basen aufweisen (E523Q/wt; wt/D500N; wt/D500E; E523Q/D500N; E523Q/D500E). Für die Analyse des Hydrolyse‐ Zyklus wurde zunächst die heterologe Expression der TmrAB‐Konstrukte in E. coli optimiert. Im Anschluss wurden die Solubilisation und die Ni‐Chelat‐Affinitäts‐Reinigung des Proteinkomplexes über den an die TmrA‐Untereinheit gekoppelten His‐tag etabliert, was in einer Proteinausbeute von ca. 0,2 mg Proteinkomplex pro Liter Zellkultur resultierte. Es konnten alle Konstrukte in vergleichbaren Mengen gereinigt werden. Die Heterodimer‐Ausbildung von TmrAB konnte mittels MALDI‐MS, Gelfiltration und LILBID‐MS verifiziert werden. Um die Funktionalität des gereinigten Proteinkomplexes nachzuweisen, wurde anschließend die ATP‐Hydrolyse detailiert untersucht. Wildtyp‐ TmrAB zeigte hierbei eine temperaturabhängige ATPase‐Aktivität, die mit der optimalen Wachstumstemperatur von T. thermophilus (49 – 72°C) korreliert. Diese konnte spezifisch mit BeFx und ortho‐Vanadat, welche die Arretierung von Nukleotiden in der Nukleotidbindetasche erlauben, inhibiert werden. Weiterhin konnte ein Km,ATP von 0,9 mM und eine maximale Umsatzrate von 9 ATP/s bei 68°C ermittelt werden. Für ein besseres Verständnis des Hydrolyse‐Zyklus wurden die ATP‐Bindung und ATP‐Hydrolyse Eigenschaften der unterschiedlichen TmrAB‐Konstrukte mittels ATPase‐ und azido‐ATPQuervernetzungs‐Experimenten überprüft. Mutationen des katalytischen Glutamats in Position 523 in der TmrA‐Untereinheit führten zu einer vollständigen Inhibition der ATPase‐Reaktion, wohingegen der Austausch des Aspartats 500 in der TmrB‐Seite keinen Einfluss auf die Michaeliskonstante und ATP‐Umsatzrate hatte. Radioaktive Nukleotid‐ Trapping‐Experimente zeigten den Einschluss von zwei Nukleotiden in den NBDs des Transportkomplexes, welcher entweder durch Behandlung mit Vanadat oder durch Mutation des Glu‐523 (TmrA) vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, dass das Glu‐523 in der kanonischen Seite für die Konversion des ATP/ATP‐gebunden Zustands in den ADP/ATP‐Zustand verantwortlich ist, wohingegen das Asp‐500 ausschließlich eine regulatorische Rolle übernimmt und nicht direkt in die Hydrolyse‐Reaktion involviert ist. Überraschenderweise konnte diese Asymmetrie im TmrAB‐Komplex nicht durch die Einführung eines Glutamats in der nicht‐kanonischen TmrB‐Untereinheit behoben werden. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Asymmetrie nicht auf Mutation eines einzelnen Aminosäurerests basiert, sondern vielmehr auf einer intrinsischen Eigenschaft der TmrB‐NBD bzw. des gesamten Proteinkomplexes beruht. Die Ergebnisse zeigen essentielle Unterschiede zwischen dem Hydrolyse‐Mechanismus des asymmetrischen TmrAB‐Komplexes und den für symmetrische Transporter postulierten Mechanismen, was generelle Unterschiede im Substrattransport von kanonischen und nicht‐kanonischen Transportern vermuten lässt. Neben der Analyse des Hydrolyse‐Mechanismus wurde im Rahmen dieser Arbeit die Substratspezifität von TmrAB charakterisiert. Hierfür wurden Hoechst 33342‐Transportstudien in invertierten (inside‐out) E. coli Vesikeln durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass TmrAB eine temperaturabhängige Translokation der Multidrug‐Komponente vermittelt, welche durch Verapamil spezifisch inhibiert werden kann. Überraschenderweise ist dieser Transportvorgang nicht nur von der ATP‐Hydrolyse sondern auch vom Membranpotential abhängig. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Hoechst 33342 konzentrationsabhängig die TmrAB spezifische ATPase‐Reaktion inhibiert. Die Daten implizieren eine direkte und spezifische Interaktion von TmrAB mit Hoechst 33342, was den ABC‐Komplex als Mitglied der Multidrug‐Resistenz ABC‐Familie verifiziert. Als zweites ABC‐Exportprotein wurde in dieser Arbeit MDL1 charakterisiert, welches in der inneren mitochondrialen Membran in S. cerevisiae lokalisiert ist. MDL1 ist ein homodimerer ABC‐Komplex, der wie TmrAB die typische Domänenarchitektur von ABCExportern aufweist. Für MDL1 wurde postuliert, dass es den Transport von Protein‐ Fragmenten aus der mitochondrialen Matrix vermittelt und dadurch die Kommunikation der Mitochondrien mit der zellulären Umgebung ermöglicht. Weiterhin wurde für MDL1 eine Funktion in der zytosolischen Eisen‐Schwefel‐Cluster‐Assemblierung und eine Rolle beim Schutz der Zelle vor oxidativem Stress vorgeschlagen. Bis zum heutigen Tag ist jedoch das physiologische Substrat von MDL1 wie auch das aller anderen mitochondrialen ABC‐Transporter nicht bekannt. Basierend auf Hefe‐Komplementations‐Studien konnte ausgeschlossen werden, dass MDL1 eine Resistenz der Mitochondrien gegen oxidativen Stress vermittelt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass MDL1 teilweise die Funktion des mitochondrialen ABC‐Transporters ATM1, welcher die zytosolische Eisen‐Schwefel‐Cluster‐Formation vermittelt, übernehmen kann, was ein überlappendes Substratspektrum beider Proteine impliziert. Um weitere Einblicke in die Substratspezifität von MDL1 zu erhalten, wurden die Solubilisations‐ und Reinigungsbedingungen dieses ABC‐Proteins optimiert. Die Funktionalität des gereinigten homodimeren MDL1‐Komplexes wurde durch die ATP‐Hydrolyse überprüft. Das Wildtyp‐Protein zeigte einen Km,ATP‐Wert von 0,8 mM und einen ATP‐Umsatz von 2,4 s‐1 (pro Monomer) bei 30°C, wohingegen Mutationen der katalytischen Base E599 sowie des H‐loops (H631) die ATPase‐Reaktion vollständig inhibierten. Basierend auf der funktionalen Reinigung des MDL1‐Komplexes wurden verschiedene Substanzen als putative Substrate getestet. Weder der Einsatz von kombinatorischen Peptid‐Bibliotheken noch der von ATM1‐spezifischen Substraten wie Cystein‐haltigen Peptiden oder anderen Thiol‐haltige Substanzen führten zu einer Stimulation der MDL1 katalysierten ATPHydrolyse. Die Ergebnisse suggerieren, dass MDL1 möglicherweise ein sehr kleines Spektrum an spezifischen Peptiden oder modifizierten Peptiden transportiert, welche in den verwendeten Bibliotheken unterrepräsentiert sind.

RNA recognition by fluoro aromatic substituted nucleic acid analogues (2005)

Aleksandra Zivkovic

NOSTRIN - ein neuer Interaktionspartner der endothelialen NO-Synthase (2002)

Kirstin Zimmermann

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiger Botenstoff, der über die Regulation des Vasotonus, die Hemmung der Thrombocytenaggregation sowie die Stimulation der Angiogenese auf die vaskuläre Homöostase einwirkt. Das wichtigste NO-produzierende Enzym im kardiovaskulären System ist die endotheliale NO-Synthase (eNOS), deren Aktivität durch posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung und Acylierung, durch Interaktionen mit regulatorischen Proteinen wie Ca2 /Calmodulin und Caveolin sowie durch differentielle subzelluläre Lokalisation reguliert wird. Dabei sind die Faktoren, welche die (Trans-)Lokation der eNOS zwischen subzellulären Kompartimenten wie den Caveolae der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat dirigieren, weitgehend unbekannt. Zur Identifizierung neuer Interaktionspartner wurde humane eNOS im "yeast two-hybrid"-System als "Köderprotein" eingesetzt und dabei das Fragment eines neuen humanen Proteins identifiziert, das vorläufig NOSTRIN (für: eNOS traffic inducer) genannt wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang nun die Klonierung der kompletten NOSTRIN-cDNA, der Nachweis einer spezifischen Interaktion von eNOS und NOSTRIN in Säugerzellen sowie die Charakterisierung von NOSTRIN als Modulator der subzellulären Lokalisation und Aktivität von eNOS. Nach der kompletten Klonierung der NOSTRIN-cDNA mit Hilfe einer 5'-RACE resultierte ein offenes Leseraster von 506 Aminosäuren entsprechend einer Größe von ca. 58 kDa für NOSTRIN. Eine Datenbankrecherche zum Vergleich der NOSTRIN-Sequenz mit Sequenzen bekannter Proteinmotive ergab die Vorhersage einer N-terminalen Cdc15-Domäne sowie einer C-terminalen SH3-Domäne. Die direkte Interaktion zwischen eNOS und NOSTRIN konnte durch Copräzipitation in vivo und in vitro bestätigt werden. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass die SH3-Domäne von NOSTRIN essentiell für die Bindung an eNOS ist. Zur Untersuchung des Einflusses von NOSTRIN auf die eNOS-Lokalisation wurden stabil transfizierte CHO-Zellen, die eNOS überexprimierten ("CHO-eNOS") eingesetzt. In der Immunofluoreszenz war eNOS vornehmlich in Assoziation mit der Plasmamembran und dem Golgi-Apparat zu sehen. Mit Hilfe des Semliki-Forest-Virussystems (SFV) wurde nun NOSTRIN transient überexprimiert; dabei zeigte sich für NOSTRIN eine vesikelartige Verteilung im Cytoplasma. Die NOSTRIN-Überexpression führte zu einer drastischen Umverteilung von eNOS, die nun in charakteristischen vesikelartigen Strukturen mit NOSTRIN colokalisierte. Die Verwendung von NOSTRIN-Konstukten, bei denen die SH3- Domäne deletiert war ("NOSTRIN.SH3"), veränderte zwar die typische NOSTRIN-Lokalisation nicht, ließ aber auch die subzelluläre Verteilung von eNOS unverändert, so dass NOSTRIN.SH3 und eNOS in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert waren. Mit Hilfe der Immunofluoreszenz konnte ebenfalls eine Colokalisation von NOSTRIN und Caveolin-1, einem inhibitorisch wirkenden Interaktionspartner von eNOS, nachgewiesen werden. Die Analyse von Copräzipitationen mit NOSTRIN bzw. NOSTRIN.SH3 zeigte, dass Caveolin-1 in eNOS-unabhängiger Weise an NOSTRIN bindet, so dass ein ternärer Komplex aus NOSTRIN, eNOS und Caveolin-1 resultiert. Zur Klärung der Frage, ob NOSTRIN neben der subzellulären Lokalisation auch die Aktivität von eNOS beeinflusst, wurde die NO-Freisetzung von CHO-eNOS-Zellen analysiert. Dabei ergab sich, dass die transiente Überexpression von NOSTRIN in CHO-eNOS-Zellen die eNOS-Aktivität um 62 % im Vergleich zu Kontrollzellen reduzierte. In humanen primären Endothelzellen konnte mittels Immunoblotting und Immunofluoreszenzmikroskopie das Vorkommen von endogenem NOSTRIN sowie dessen Colokalisation mit endogener eNOS an der Plasmamembran nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation führen zur Hypothese, dass NOSTRIN als "molekulare Klammer" zwischen eNOS und Caveolin-1 dient, eine dynamische Umverteilung von eNOS innerhalb der Zelle vermittelt und damit das Enzym - direkt und/oder indirekt - inhibiert. Somit dürfte NOSTRIN als Modulator der Aktivität und Lokalisation von eNOS eine wichtige Rolle bei der Regulation der endothelialen NO-Produktion spielen.

A novel, non-invasive, online-monitoring, versatile and easy plant-based probe for measuring leaf water status (2008)

Dirk Zimmermann Randolph Reuss Markus Westhoff Petra Geßner Matthias Wolf Bauer Ernst Bamberg Friedrich-Wilhelm Bentrup Ulrich Zimmermann

A high-precision pressure probe is described which allows non-invasive online-monitoring of the water relations of intact leaves. Real-time recording of the leaf water status occurred by data transfer to an Internet server. The leaf patch clamp pressure probe measures the attenuated pressure, Pp, of a leaf patch in response to a constant clamp pressure, Pclamp. Pp is sensed by a miniaturized silicone pressure sensor integrated into the device. The magnitude of Pp is dictated by the transfer function of the leaf, Tf, which is a function of leaf patch volume and ultimately of cell turgor pressure, Pc, as shown theoretically. The power function Tf=f(Pc) theoretically derived was experimentally confirmed by concomitant Pp and Pc measurements on intact leaflets of the liana Tetrastigma voinierianum under greenhouse conditions. Simultaneous Pp recordings on leaflets up to 10 m height above ground demonstrated that changes in Tf induced by Pc changes due to changes of microclimate and/or of the irrigation regime were sensitively reflected in corresponding changes of Pp. Analysis of the data show that transpirational water loss during the morning hours was associated with a transient rise in turgor pressure gradients within the leaflets. Subsequent recovery of turgescence during the afternoon was much faster than the preceding transpiration-induced water loss if the plants were well irrigated. Our data show the enormous potential of the leaf patch clamp pressure probe for leaf water studies including unravelling of the hydraulic communication between neighbouring leaves and over long distances within tall plants (trees).

Electrophysiological and spectroscopical characterization of the Na,K-ATPase (2005)

Giovanni Zifarelli

The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...

The oriented and patterned growth of fluorescent metal–organic frameworks onto functionalized surfaces (2012)

Jinliang Zhuang Jasmin Friedel Andreas Terfort

A metal–organic framework (MOF) material, [Zn2(adc)2(dabco)] (adc = anthracene-9,10-dicarboxylate, dabco = 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane), the fluorescence of which depends on the loading of its nanopores, was synthesized in two forms: as free-flowing nanocrystals with different shapes and as surface-attached MOFs (SURMOFs). For the latter, we used self-assembled monolayers (SAMs) bearing functional groups, such as carboxylate and pyridyl groups, capable of coordinating to the constituents of the MOF. It could be demonstrated that this directed coordination also orients the nanocrystals deposited at the surface. Using two different patterning methods, i.e., microcontact printing and electron-beam lithography, the lateral distribution of the functional groups could be determined in such a way that the highly localized deposition of the SURMOF films became possible.

Electrogenic substrate binding to the Na +/proline transporter of E. coli (2005)

Aihua Zhou

The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.

Synthese und Charakterisierung von Metallasiloxanen - auf dem Weg zu molekularen Magneten (2007)

Larysa Zherlitsyna

Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Synthese und strukturellen Charakterisierung von sandwichartig aufgebauten kupferhaltigen Organosiloxanen. Diese sollten nach Möglichkeit kristalline Eigenschaften aufweisen und ein interessantes magnetisches Verhalten zeigen. Es galt, die Beziehungen zwischen molekularer Struktur und magnetischen Eigenschaften herauszuarbeiten, um auf der Basis experimenteller Daten dem maßgeschneiderten Design neuer molekularer Magnete näher zu kommen. .... Die in der hier vorgelegten Arbeit erzielten Ergebnisse belegen, dass der Weg zur gezielten Erzeugung molekularer Magnete erfolgreich beschritten wurde. Es wird weiteren Arbeiten vorbehalten bleiben, Cluster der nun vorliegenden Art chemisch so zu verknüpfen, dass daraus polymere Ketten oder Netzwerke entstehen. Deren magnetisches Verhalten lässt erwarten, dass damit möglicherweise neue Materialien zugänglich werden, die dem Anspruch eines molekularen Magneten voll gerecht werden.

Reciprocal t(9;22) ABL/BCR fusion proteins: leukemogenic potential and effects on B cell commitment (2009)

Xiaomin Zheng Claudia Oancea Reinhard Henschler Malcolm A. S. Moore Martin Ruthardt

Background: t(9;22) is a balanced translocation, and the chromosome 22 breakpoints (Philadelphia chromosome – Ph+) determine formation of different fusion genes that are associated with either Ph+ acute lymphatic leukemia (Ph+ ALL) or chronic myeloid leukemia (CML). The "minor" breakpoint in Ph+ ALL encodes p185BCR/ABL from der22 and p96ABL/BCR from der9. The "major" breakpoint in CML encodes p210BCR/ABL and p40ABL/BCR. Herein, we investigated the leukemogenic potential of the der9-associated p96ABL/BCR and p40ABL/BCR fusion proteins and their roles in the lineage commitment of hematopoietic stem cells in comparison to BCR/ABL. Methodology: All t(9;22) derived proteins were retrovirally expressed in murine hematopoietic stem cells (SL cells) and human umbilical cord blood cells (UCBC). Stem cell potential was determined by replating efficiency, colony forming - spleen and competitive repopulating assays. The leukemic potential of the ABL/BCR fusion proteins was assessed by in a transduction/transplantation model. Effects on the lineage commitment and differentiation were investigated by culturing the cells under conditions driving either myeloid or lymphoid commitment. Expression of key factors of the B-cell differentiation and components of the preB-cell receptor were determined by qRT-PCR. Principal Findings: Both p96ABL/BCR and p40ABL/BCR increased proliferation of early progenitors and the short term stem cell capacity of SL-cells and exhibited own leukemogenic potential. Interestingly, BCR/ABL gave origin exclusively to a myeloid phenotype independently from the culture conditions whereas p96ABL/BCR and to a minor extent p40ABL/BCR forced the B-cell commitment of SL-cells and UCBC. Conclusions/Significance: Our here presented data establish the reciprocal ABL/BCR fusion proteins as second oncogenes encoded by the t(9;22) in addition to BCR/ABL and suggest that ABL/BCR contribute to the determination of the leukemic phenotype through their influence on the lineage commitment.

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