Universitätspublikationen
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Alpine crossroads or origin of genetic diversity? : Comparative phylogeography of two sympatric microgastropod species
(2012)
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Alexander M. Weigand
Markus Pfenninger
Adrienne Jochum
Annette Klussmann-Kolb
- The Alpine Region, constituting the Alps and the Dinaric Alps, has played a major role in the formation of current patterns of biodiversity either as a contact zone of postglacial expanding lineages or as the origin of genetic diversity. In our study, we tested these hypotheses for two widespread, sympatric microgastropod taxa - Carychium minimum O.F. Müller, 1774 and Carychium tridentatum (Risso, 1826) (Gastropoda, Eupulmonata, Carychiidae) - by using COI sequence data and species potential distribution models analyzed in a statistical phylogeographical framework. Additionally, we examined disjunct transatlantic populations of those taxa from the Azores and North America. In general, both Carychium taxa demonstrate a genetic structure composed of several differentiated haplotype lineages most likely resulting from allopatric diversification in isolated refugial areas during the Pleistocene glacial periods. However, the genetic structure of Carychium minimum is more pronounced, which can be attributed to ecological constraints relating to habitat proximity to permanent bodies of water. For most of the Carychium lineages, the broader Alpine Region was identified as the likely origin of genetic diversity. Several lineages are endemic to the broader Alpine Region whereas a single lineage per species underwent a postglacial expansion to (re)colonize previously unsuitable habitats, e.g. in Northern Europe. The source populations of those expanding lineages can be traced back to the Eastern and Western Alps. Consequently, we identify the Alpine Region as a significant 'hot-spot' for the formation of genetic diversity within European Carychium lineages. Passive dispersal via anthropogenic means best explains the presence of transatlantic European Carychium populations on the Azores and in North America. We conclude that passive (anthropogenic) transport could mislead the interpretation of observed phylogeographical patterns in general.
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Role of the AMP-activated protein kinase in endothelial permeability and inflammatory events
(2011)
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Elke Beß
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Die Rolle von Stat3 in Gliomen
(2011)
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Maike Priester
- Pharmakologische und genetische Inhibition von Stat3 und deren Auswirkungen im syngenen Maus-Gliom-Modell
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Charakterisierung des zellulären Co-Faktors DDX3 für die HIV-1-Replikation im Hinblick auf biochemische Eigenschaften und Inhibition durch Peptidliganden
(2011)
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Sandra Beermann
- Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
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Development of lentiviral vectors for the gene therapy of X-linked chronic granulomatous disease
(2010)
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Christian Brendel
- Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, die auf einen einzelnen Gendefekt zurückzuführen sind (monogene Erkrankungen). Darunter befindet sich auch die Gruppe der primären Immundefizienzen (PIDs), von denen aktuell über 150 verschiedene Typen von der Weltgesundheitsorganisation registriert sind. In vielen fällen leiden betroffene Individuen unter einem stark erhöhten Infektionsrisiko durch bakterielle oder virale Pathogene, sowie den damit verbundenen schweren Symptomen - bis hin zum verfrühten Tod der Patienten. Meist können PIDs mit konventionellen Methoden präventiv behandelt werden. Dazu gehören zum Beispiel die regelmässige Gabe von Antibiotika, Antimykotika, Zytokinen oder Immunglobulinen. Der einzige zur Verfügung stehende kurative Behandlungsansatz beruht auf der Transplantation von hämatopoietischen Stammzellen (HSZT) eines gesunden und passenden Spenders. Häufig steht jedoch kein histokompatibler Spender zur Verfügung.
Für diese Patientengruppe hat sich die gentherapeutische Behandlung mit autologen hämatopoietischen Stammzellen als eine gute Option herausgestellt. Der Beweis hierfür wurde eindrucksvoll in klinischen Heilversuchen für zwei Formen des Schweren Kombinierten Immundefekts (X-SCID und ADA-SCID) geführt, einer Erkrankung die durch das vollständige Fehlen bzw. die nicht-Funktionalität der lymphoiden Immunzellen charakterisiert ist. Autologe hämatopoietische Stammzellen der Patienten wurden hier ex vivo mittels eines gamma-retroviralen Vektors mit einer funktionellen Kopie der defekten cDNA genetisch modifiziert und anschliessend zurück infundiert. In der Summe wurde bei über 30 Patienten eine deutliche Verbesserung des Gesundheitszustandes bis hin zur vollständigen Heilung erzielt. Bei einem vergleichbaren Ansatz wurden in Frankfurt, in einem Heilversuch für die septische Granulomatose (X-CGD), erstmals klinisch relevante Erfolge in der Gentherapie für einen Defekt in der myeloischen Linie von Immunzellen erzielt. Ursache der X-chromosomal gekoppelten Form der septischen Granulomatose sind Mutationen in dem Gen für gp91phox (CYBB), einer essentiellen Untereinheit des in Phagozyten benötigten NADPH-Oxidase Komplexes. In der Folge sind die Phagozyten dieser Patienten nicht mehr in der Lage, die für das Abtöten von Krankheitserregern nötigen reaktiven Sauerstoffspezies zu bilden. Ständig wiederkehrende schwere Infektionen mit sonst unproblematischen Erregern sind die Folge.
Neben klaren gesundheitlichen Verbesserungen in der Mehrzahl der Patienten hatte diese Gentherapeutische Behandlungsstrategie in einigen Fällen auch klare Nebenwirkungen. In fünf von 20 Patienten mit X-SCID, sowie in beiden behandelten X-CGD Patienten, kam es infolge der Therapie zu hämatologischen Veränderungen, die in der Ausbildung eines myelodysplastischen Syndroms (bei X-CGD) und Leukämie (bei X-SCID) mündeten. In allen Fällen war die Ursache eine Hochregulierung von Proto-Onkogenen in der Nähe von g-retroviralen Integrationsstellen. Diese Probleme demonstrieren deutlich die unbedingte Notwendigkeit zur Verbesserung der verwendeten therapeutischen Vektoren.
In der vorliegenden Arbeit wurden lentivirale Vektoren mit myeloid-spezifischen Promotoren entwickelt und auf ihre Eignung für die Gentherapie der X-chromosomal gekoppelten septischen Granulomatose getestet. Lentivirale Vektoren besitzen ein stark verringertes Risiko für Insertionsmutagenese, sowie die exklusive Fähigkeit ruhende Zellen zu transduzieren. Die Verwendung von myeloid-spezifischen Promotoren für die Transgenexpression verringert die Wahrscheinlichkeit der Proto-Onkogen Aktivierung in unreifen Stamm- und Vorläuferzellen – einer Zellpopulation die besonders sensitiv für die in der Leukämieentstehung obligaten Schritte der Immortalisierung und Transformation ist. Gleichzeitig bleibt der volle therapeutische Nutzen erhalten, da das Transgen gp91phox nur in reifen myeloischen Zellen benötigt wird.
Die entwickelten lentiviralen Vektoren exprimieren eine kodonoptimierte gp91phox cDNA unter der Kontrolle des microRNA223-Promoters (223), des MRP8-Promotors (M) oder eines chimären Fusionspromoters bestehend aus den regulatorischen Bereichen des Cathepsin G und des cFes-Promotors (Chim). Zusätzlich wurde ein sogenanntes „ubiquitär aktives Chromatin-öffnendes Element“ (UCOE) in beiden Orientierungen vor den MRP8-Promotor kloniert, um eine erhöhte und stabile Langzeitexpression des Transgens zu erreichen. Ziel der Arbeit war die Selektion eines geeigneten Kandidaten für präklinische Versuchsreihen.
Die für die Evaluierung der Vektoren relevanten Parameter waren die Transgenexpressionslevel, die Spezifität der Expression für myeloische Zellen sowie die vermittelte funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität. Die Fragestellungen der Langzeitexpression, der Anfälligkeit für CpG-Methylierung sowie der Genotoxizität der Vektoren wurden ebenfalls bearbeitet. Die Vektoren wurden in vitro in verschiedenen Zelllinien sowie in in vitro differenzierten primären murinen und humanen Blutstammzellen getestet. Die beiden besten Kandidaten (223 und Chim) wurden in vivo in Maustransplantationsexperimenten (Maus-Maus und humane Stammzellen in NOD/SCID-Mäuse) analysiert.
Die beiden lentiviralen Vektoren 223 und Chim eignen sich beide für eine effiziente Expression in myeloische Zellen, die zur funktionellen Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität in vitro und in vivo führen. Sie sind den bisher in klinischen Anwendungen verwendeten Vektoren in allen Parametern klar überlegen. Daher ist in zukünftigen klinischen Anwendungen ein verbesserter therapeutischer Nutzen für die Patienten sowie eine Verminderung des Risikos von Nebenwirkungen zu erwarten.
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Restriction of HIV-1 replication in monocytes is abolished by Vpx of SIVsmmPBj
(2009)
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Silke Schüle
Björn-Philipp Kloke
Julia Kaiser
Sabine Heidmeier
Sylvia Panitz
Nina Wolfrum
Klaus Cichutek
Matthias Schweizer
- Background: Human primary monocytes are refractory to infection with the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) or transduction with HIV-1-derived vectors. In contrast, efficient single round transduction of monocytes is mediated by vectors derived from simian immunodeficiency virus of sooty mangabeys (SIVsmmPBj), depending on the presence of the viral accessory protein Vpx.
Methods and Findings: Here we analyzed whether Vpx of SIVsmmPBj is sufficient for transduction of primary monocytes by HIV-1-derived vectors. To enable incorporation of PBj Vpx into HIV-1 vector particles, a HA-Vpr/Vpx fusion protein was generated. Supplementation of HIV-1 vector particles with this fusion protein was not sufficient to facilitate transduction of human monocytes. However, monocyte transduction with HIV-1-derived vectors was significantly enhanced after delivery of Vpx proteins by virus-like particles (VLPs) derived from SIVsmmPBj. Moreover, pre-incubation with Vpx-containing VLPs restored replication capacity of infectious HIV-1 in human monocytes. In monocytes of non-human primates, single-round transduction with HIV-1 vectors was enabled.
Conclusion: Vpx enhances transduction of primary human and even non-human monocytes with HIV-1-derived vectors, only if delivered in the background of SIVsmmPBj-derived virus-like particles. Thus, for accurate Vpx function the presence of SIVsmmPBj capsid proteins might be required. Vpx is essential to overcome a block of early infection steps in primary monocytes.
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Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 auf die Osteoklastogenese durch Regulation von DC-STAMP
(2012)
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Nadine Courtial
- Das menschliche Knochengewebe unterliegt einem ständigen Auf- und Abbau. Der
Knochenumbau, die so genannte Knochenremodellierung, findet stetig statt und etwa 10 %
des gesamten Knochengewebes werden innerhalb eines Jahres erneuert (Lerner UH, 2006).
Während der Knochenremodellierung befindet sich die Zellaktivität der Knochenaufbauenden
Osteoblasten und der Knochen-abbauenden Osteoklasten in einem
empfindlichen Gleichgewicht (Karsenty G und Wagner EF, 2002; Teitelbaum SL, 2000).
Durch Störung des Gleichgewichts zwischen Osteoblasten und Osteoklasten kann es zu
Knochen-assoziierten Krankheiten wie Osteoporose oder Osteopetrose kommen (Helfrich
MH, 2003; Sambrook P und Cooper C, 2006).
Osteoklasten sind multinukleäre Zellen, die in der Lage sind die Knochenmatrix zu
resorbieren (Teitelbaum SL, 2000). Sie entstehen aus pluripotenten, hämatopoetischen
Stammzellen durch Differenzierung und Zellfusion von Monozyten/Makrophagen-
Vorläuferzellen (Menaa C et al., 2000, Yavropoulou MP und Yovos JG, 2008). Die
Osteoklasten-Differenzierung wird hauptsächlich durch die Zytokine M-CSF (macrophage
colony stimulating factor) und RANKL (receptor activator of nuclear factor k b ligand)
induziert. Sie initiieren ein spezifisches Expressionsmuster Osteoklasten-spezifischer Gene
und aktivieren die Zellfusion in Osteoklasten-Vorläuferzellen zur Bildung reifer Osteoklasten
(Boyle WJ et al., 2003; Asagiri M und Takayanagi H, 2007). Die RANKL-vermittelte Induktion
der Osteoklastogenese beruht auf der Initiierung eines streng regulierten Netzwerks aus
Transkriptionsfaktoren (Yang X und Karsenty G, 2002). Einige Transkriptionsfaktoren, die
während der Osteoklasten-Differenzierung induziert und exprimiert werden, sind nicht auf
Osteoklasten beschränkt. Sie erfüllen auch Aufgaben in anderen hämatopoetischen
Differenzierungsprozessen (Engel I und Murre C et al., 1999), so dass vermutlich die
Kombination der Transkriptionsfaktoren entscheidend für die Osteoklastogenese ist.
Der basic helix-loop-helix-Transkriptionsfaktor Tal1 (T-cell acute lymphocytic
leukemia 1, auch Scl1, stem cell leukemia 1) ist ein entscheidender Faktor in der primitiven
und der definitiven Hämatopoese (Bloor AJ et al., 2002; Shivdasani RA et al., 1996). Die
Expression von Tal1 konnte bisher in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien gezeigt
werden, u.a. in monozytischen Zellen (Elefanty AG et al., 1998; Green AR et al., 1992;
Pulford K et al., 1995; Dey S et al., 2010).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 in
Monozyten und reifen Osteoklasten, vor allem in Bezug auf genregulatorische Prozesse
während der Osteoklasten-Differenzierung, untersucht. Der Transkriptionsfaktor Tal1 wird
in vitro und in vivo in Osteoklasten-Vorläuferzellen und reifen Osteoklasten exprimiert. Die
Proteinexpression von Tal1 wird durch die Inkubation der Zellen mit RANKL induziert, jedoch
wurde dies in Bezug auf die mRNA-Expression von Tal1 nicht beobachtet, so dass
vermutlich eine posttranskriptionelle Regulation von Tal1 vorliegt.
Die Überexpression von Tal1 sorgte für eine Blockade der Differenzierung von
Osteoklasten-Vorläuferzellen in reife Osteoklasten. Der Verlust von Tal1 in primären
Monozyten/Makrophagen-Zellen führte zur veränderten Expression von über 1200 Genen,
wobei jeweils etwa 600 Gene herauf- bzw. herabreguliert waren. Dies verdeutlicht, dass Tal1
sowohl an der Aktivierung als auch an der Reprimierung der Genexpression in Osteoklasten-
Vorläuferzellen beteiligt ist. Die Liste der herabregulierten Gene beinhaltete u.a. das
Osteoklasten-spezifische Enzym Acp5 (auch TRAP, tartrate resistant acid phosphatase), die
Liste der herauf regulierten Gene beinhaltete u.a. DC-STAMP (dendritic cell specific
transmembrane protein) und ATP6V0D2 (d2 isoform of vascuolar ATPase V0 domain), beide
werden im Zusammenhang mit der Zellfusion während der Osteoklasten-Differenzierung
beschrieben (Kim K et al., 2008; Kim T et al., 2010; Yagi M et al., 2005). Der Promotor von
DC-STAMP beinhaltet mehrere potentielle Bindestellen für Tal1 und Osteoklastenspezifische
Transkriptionsfaktoren. Es konnte gezeigt werden, dass Tal1, PU.1 und MITF im
Bereich um 343 bp vor dem Transkriptionsstartpunkt des DC-STAMP-Promotors binden und
dass Tal1 mit den Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren PU.1 und MITF
interagiert. Der inhibitorische Effekt von Tal1 auf die Osteoklasten-Differenzierung kommt
durch die Reprimierung der Aktivität der Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren
PU.1 und MITF auf dem DC-STAMP-Promotor in Osteoklasten-Vorläuferzellen zustande.
Während der Osteoklastogenese kommt es zu einer verringerten Tal1-Bindung auf dem DCSTAMP-
Promotor, wodurch die Tal1-vermittelte Inhibierung der Expression aufgehoben wird.
Die Bindung von PU.1 und MITF auf dem Promotor von DC-STAMP nimmt während der
Osteoklasten-Differenzierung zu. Die Expression von DC-STAMP wird im Verlauf der
Osteoklastogenese induziert, wodurch es zur Zell-Zell-Fusion kommt.
Die Analyse des transkriptionellen Netzwerks, das die Fusion mononukleärer Zellen
in reife Osteoklasten reguliert, vertieft das molekulare Verständnis der Osteoklasten-
Differenzierung und kann zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beitragen, die in
der Behandlung von Osteoporose, Riesenzelltumoren und anderen Osteoklastenassoziierten
Krankheiten verwendet werden können.
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Der Schallwahrnehmung auf der Spur : was schreckhafte Wüstenrennmäuse zur Tinnitus-Forschung beitragen können
(2011)
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Manuela Nowotny
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The nature of the imsHsp70 as a motor for the biphasic mode of chloroplast preprotein import
(2012)
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Tihana Bionda
- Plastids are complex organelles that fulfil numerous essential cellular functions, such as
photosynthesis, amino acid and fatty acid synthesis. he majority of proteins required for
these functions are encoded in the nuclear genome and synthesised on cytosolic ribosomes as
precursors, which are posttranslationally transported to and imported into the organelle by
concerted actions of translocons in the outer and inner chloroplast membrane. For most
preproteins, targeting to the organelle is ensured by a specific import signal, a so called
transit peptide, which is specifically recognised by receptors at the chloroplastês surface. A transit peptide is generally defined as essential and sufficient for precursor targeting to and
translocation into chloroplasts, (however, an analysis of the ability of transit peptides to drive translocation of tightly folded passenger domain revealed that the transit peptide is not
always sufficient for the translocation event. A critical signal length requirement of amino
acids has been determined in vivo and in vitro. In the case of shorter transit peptide, the
succeeding portion of the mature domain provides an extension of an unfolded polypeptide
stretch required for successful translocation. The analysis of the unfolding mode of a folded
model passenger during translocation links the observed transit peptide length requirement
to the action of an energising unit present in the intermembrane space of chloroplasts.
The likely candidate for this energising unit space is putative imsHsp70, previously hypothesised to function in translocation of precursor proteins across the outer membrane. However, as the identity of this protein has up to now remained unknown, its existence has
been a matter of debate. The present study focuses on the isolation and characterisation of
imsHsp70 at the molecular level. Mass spectrometry analyses and in vivo localisation studies
demonstrate that while no specific imsHsp70 exists, multiple cytosolic Hsp70 isoforms are
targeted to the intermembrane space, but not to the stroma of chloroplasts. Thus, a so far unrecognised mode of dual targeting to chloroplasts and cytosol is most likely to ensure the
allocation of (sp s into the intermembrane space.
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Biochemical characterization of Fucoxanthin Chlorophyll a/c binding proteins in the diatom Phaeodactylum tricornutum
(2012)
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Jidnyasa Joshi
- Diatoms contribute largely to the total primary production of the ecosphere and are key players in global biogeochemical cycles. Their chloroplasts are surrounded by four membranes owing to their secondary endosymbiotic origin. Their thylakoids are arranged into three parallel bands and differentiation of thylakoid membranes into grana or stroma is not observed. The fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins act as the light harvesting proteins and play a role in photoprotection during excess light as well. The diatom genome encodes three different families of antenna proteins. Family I are the classical light harvesting proteins called "Lhcf". Family II are the red algae related Lhca-R1/2 proteins called "Lhcr" and family III are the photoprotective LI818 related proteins called "Lhcx".
All known Fcps have a molecular weight in the range of 17-23 kDa. They are membrane proteins and have shorter loops and termini compared to LHCs of higher plants and are therefore extremely hydrophobic. This makes the isolation of single specific Fcps using routine protein purification techniques difficult.
The purification of a specific Fcp containing complex has not been achieved so far and until this is done several questions concerning light harvesting antenna systems of diatoms cannot be answered. For e.g. Which proteins interact specifically? Are various Fcps differently pigmented? Which pigments interact with each other and how? Which proteins contribute to photosystem specific antenna systems? Can pure Fcps be reconstituted into crystals like LHCII proteins? In order to answer these questions specific Fcp containing complexes have to be purified. ...
