OPUS 4 | Universitätspublikationen

Wirkfaktoren in der kognitiven Therapie der Sozialen Phobie (2011)

Katrin von Consbruch

Soziale Phobie gilt als eine der am weitesten verbreiteten psychischen Störungen (Wittchen & Fehm, 2003; Magee et al., 1996). Obgleich zahlreiche Interventionsansätze zur Behandlung der sozialen Ängste zur Verfügung stehen, gibt es viele Betroffene, die nicht von den Behandlungsmöglichkeiten profitieren oder nach einer Therapie Rückfälle erleben. Aus diesem Grund beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Weiterentwicklung von Psychotherapie bei Sozialer Phobie. Sie greift verschiedene Forschungsperspektiven auf, um aktive Wirkfaktoren im therapeutischen Prozess zu identifizieren und für zukünftige Behandlungen nutzbar zu machen. Publikation 1 (Consbruch & Stangier, 2007) gibt einen Überblick über den aktuellen Forschungsstand bzgl. der Diagnostik, Ätiologie und Therapie bei Sozialer Phobie. Die in dieser Publikation dargestellten Forschungsarbeiten zur Behandlung sozialer Ängste vergleichen die therapeutische Wirksamkeit unterschiedlicher Therapieansätze und suchen so nach spezifischen Wirkfaktoren in der Behandlung Sozialer Phobien. Es zeigt sich, dass die kognitiv-verhaltenstherapeutische Behandlung am häufigsten untersucht wurde und dass sich ihre Effektivität durch die Berücksichtigung von Prozessen, die nach Clark und Wells (1995) an der Entstehung und Aufrechterhaltung der Sozialen Ängste beteiligt sind, erheblich verbessern lässt. Publikation 2 (Stangier, Consbruch, Schramm & Heidenreich, 2010) verlässt die ausschließlich an spezifischen Wirkmechanismen interessierte Forschungsperspektive und wendet sich der Frage nach dem Zusammenspiel von spezifischen und allgemeinen Wirkfaktoren zu. Sie vergleicht das Ausmaß der Aktivierung von allgemeinen Wirkfaktoren nach Grawe (1995) sowie deren Einfluss auf das Therapieergebnis in einer kognitiven Verhaltenstherapie (N=29) und einer interpersonellen Therapie (N=33). Die Ergebnisse zeigen, dass Therapeuten in der Interpersonellen Psychotherapie die Aktivierung von Bewältigung, Ressourcenorientierung und Motivationaler Klärung geringer einschätzten als Therapeuten in der kognitiven Verhaltenstherapie, während sie bezüglich der Problemaktivierung und der Güte der therapeutischen Beziehung keine Unterschiede angaben. Stärkere Ressourcenaktivierung stand in beiden Therapieansätzen mit besseren Therapieergebnissen in Beziehung, während höhere Problemaktualisierung nur in KVTBehandlungen zu verbessertem Outcome beitrug. Da die Ressourcenaktivierung in der KVTBedingung stärker ausgeprägt war als in der IPT-Bedingung, lassen sich die Ergebnisse so interpretieren, dass die Problemaktualisierung nur dann zu positiveren Therapieergebnissen führt, wenn sie durch ausreichende Ressourcenaktivierung gestützt wird. Die Studie legt somit nahe, dass spezifische Behandlungsansätze allgemeine Wirkfaktoren, die einen Einfluss auf das Therapieergebnis haben, in unterschiedlichem Maße nutzen. Durch das Fehlen von Angaben zur Therapieintegrität bleibt jedoch offen, welche Rolle individuelles Therapeutenverhalten bei der Aktivierung der allgemeinen und spezifischen Wirkfaktoren spielt. Um zukünftig die Therapieintegrität in der kognitiv-verhaltenstherapeutischen Behandlung von Sozialer Phobie sicherstellen zu können, wurde die Cognitive Therapy Competence Scale for Social Phobia (CTCS-SP) entwickelt, deren psychometrische Eigenschaften in Publikation 3 (Consbruch, Clark & Stangier, in press) dargestellt werden. Zur Bestimmung der Beobachterübereinstimmung wurden 161 Therapiesitzungen von jeweils 2 Ratern mit der CTCS-SP beurteilt. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung demonstrieren eine gute interne Konsistenz und gute Interraterreliabilität der Skala, wobei erstmals auch individuelle Items mit ausreichender Reliabilität gemessen werden konnten. Mit der CTCS-SP steht somit ein reliables Messinstrument zur Erfassung therapeutischer Kompetenz in der kognitivverhaltenstherapeutischen Behandlung der Sozialen Phobie zur Verfügung, welches – bei noch zu prüfender Validität - vielfältig eingesetzt werden kann, um die Erforschung spezifischer und allgemeiner Wirkfaktoren in der kognitiv-verhaltenstherapeutischen Behandlung Sozialer Phobien zu vertiefen.

Identification of a physiological substrate of Abcg2 and its potential role in stem cells (2011)

Thomas Fischer

Stem cells are often referred to as potential candidates for the treatment of different pathologies. Their ability to differentiate into various tissue specific cell types offers the possibility to engineer cell systems or organs for replacement. One of the main questions in stem cell biology is how stemness properties are regulated and to what extend this regulation is intrinsic or conveyed by the direct microenvironment (‘niche’). In order to elucidate such regulatory processes, it is informative to analyze processes or molecules that are shared between different stem cell populations. One such molecule that is expressed on a wide range of different embryonic and adult as well as tumor stem cells is the ABC transporter Abcg2. ABC transporters in general are transmembrane proteins that actively extrude endo- and exotoxins as well as xenobiotics, thereby protecting cells and organs. Additionally, ABC transporters are responsible for drug resistance in many cancers. A well-described characteristic of stem cells expressing Abcg2 is the formation of the ‘side population’ (SP) phenotype: An active Abcg2 transporter mediates the efflux of a particular fluorescent dye that is taken up by all cells, thus leading to a less brightly stained population. This phenomenon is widely used to characterize and isolate the most primitive stem cell subpopulation from embryonic and adult tissues, including tumors. Besides its role as toxin transporter little is known about the function of Abcg2 in stem cells. This is mainly due to the fact that its physiological substrate in stem cells remains unknown. The identification of such substrates is therefore of high interest because it would directly link the activity of ABC transporters to regulatory mechanisms in stem cell biology. In the present study we wanted to test the hypothesis that the sphingolipid ceramide is a physiological substrate of the ABC transporter Abcg2. Sphingolipids are potent second messengers and are known to have regulatory functions in stem cells. In particular, the sphingolipid ceramide is described as a mediator of controlled cell death and inducer of differentiation. It is suggested that stem cells need to keep their intracellular ceramide content at low levels in order to prevent apoptosis or differentiation. We propose that Abcg2 and ceramide interact and that this interaction leads to changes in the absolute or relative amounts of ceramide. This in turn influences basic stem cell functions such as self renewal and differentiation. We show that Abcg2 prevents cells from accumulating fluorescence labeled ceramide. Furthermore, exogenously applied ceramides inhibit the transport activity of Abcg2, measured by a decrease of the side population phenotype. This inhibitory effect is consistent with a competitive inhibition mechanism. Additionally, we show that active Abcg2 can increase the ceramide concentration in cell culture supernatant. Finally we demonstrate that Abcg2 protects from ceramide induced cytotoxicity in human cell lines. In summary, these in vitro results strongly suggest that Abcg2 has the ability to regulate ceramide levels. Murine hematopoietic stem cells (HSCs) are the best characterized adult stem cell system so far. By using 7-colour fluorescence-activated cell sorting (FACS) we established the purification of the most primitive HSCs, reflected by their high engraftment capability when transplanted to lethally irradiated mice. By using this sorted cell populations it was in addition possible to establish a system to reproducibly manipulate HSCs ex vivo. This experimental system will serve in further elucidating the physiological consequences of Abcg2 mediated changes in ceramide levels on stem cells in vivo. Taken together, this study shows that Abcg2 has the ability to regulate ceramide levels in cells. This in turn can lead to cellular protection from ceramide induced apoptosis. Additionally, the experimental techniques to further analyze the role of Abcg2 and ceramide in the most primitive hematopoietic stem cells were successfully established, enabling more detailed analysis in the future.

Untersuchungen zu molekularer Expressionsregulation und biologischer Funktion von Interleukin-22 (2011)

Ina Rudloff

IL-22 wird hauptsächlich von aktivierten Leukozyten produziert, wirkt aber ausschließlich auf nicht-leukozytäre Zellen vor allem epithelialen Ursprungs. Die Funktionen des Zytokins sind strikt kontextabhängig. Einerseits aktiviert es bei infektionsgetriebenen Entzündungen die angeborene Immunität und wirkt gewebeprotektiv, andererseits weist IL-22 im Rahmen von Autoimmunerkrankungen pathogenes Potenzial auf, was vor allem auf die proliferationsfördernde Aktivität des Zytokins zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Regulation der humanen IL-22 Expression auf molekularer Ebene charakterisiert. Insbesondere die Regulation des humanen IL-22 Promotors ist bislang nicht untersucht. Darüber hinaus wurden einige biologische Eigenschaften des Zytokins näher beleuchtet. Durch Untersuchungen an der gut charakterisierten humanen T-Zelllinie Jurkat sowie durch ergänzende Versuche an humanen Primärzellen (PBMC, CD3+ T-Zellen) konnte eine relevante Funktion der Transkriptionsfaktoren NF-ATc2 und CREB sowie des IKK/NF-ΚB Signalweges bei der Regulation der IL-22 Expression nachgewiesen werden. Sowohl für NF-ATc2 als auch für den IKK-Komplex konnte dabei CsA Sensitivität gezeigt werden. CsA wird, wenn nötig, in der Therapie schwerer Verlaufsformen der Psoriasis eingesetzt und bewirkt in den Patienten unter anderem eine Reduktion der im Rahmen der Erkrankung beobachteten IL-22 Expression. Die hier vorgestellten Ergebnisse belegen erstmals eine direkte Rolle von CsA in der Reduktion der IL-22 Produktion bei immunmodulatorischer Therapie. Darüber hinaus konnte ich am Beispiel von B. burgdorferi zeigen, dass PBMC unter dem Einfluss extrazellulärer Bakterien Mediatoren freisetzen, welche die Aktivierung des IL-22 Promotors in benachbarten T-Zellen initiieren können. Dies passt zu Befunden, die belegen, dass PBMC nach Aktivierung durch B. burgdorferi eine rapide IL-22 Sekretion zeigen. Interessanterweise wird IL-17 in der frühen Phase der Aktivierung von PBMC durch B. burgdorferi nicht synthetisiert. Damit ergeben sich neue Einblicke in die Pathogenese der Spirochäteninfektion. So könnte IL-22 einen wichtigen Beitrag zum Schutz vor der borrelienassoziierten Lyme Borreliose leisten und die mangelhafte Immunabwehr, verursacht durch das Fehlen von IL-17, kompensieren. Außerdem konnte ich in der hier vorgelegten Arbeit belegen, dass Leberzirrhosepatienten signifikant erhöhte IL-22 Serumspiegel aufweisen. Da auch in Biopsien zirrhotischer Lebern IL-22 immunhistochemisch, vor allem in nicht-parenchymalen Zellen nachweisbar war, scheint die Leber der Syntheseort des im Serum detektierbaren Zytokins zu sein. Interessanterweise korrelierte IL-22 nicht nur mit der Mortalitätsrate bei Leberzirrhose, sondern auch mit der Krankheitsaktivität der betreffenden Patienten. Ein weiterer zu untersuchender Aspekt der hier vorgelegten Arbeit war die Identifizierung neuer IL-22 induzierbarer Gene. Dies geschah unter Verwendung der IL-22 responsiven, gut carakterisierten Kolonkarzinomzelllinien DLD-1 und Caco-2. Eine genomweite Expressionsstudie führte dabei zur Identifikation neuer IL-22 induzierbarer Gene, unter denen sich insbesondere CEACAM5 und NNMT befanden. Beide Proteine spielen eine Rolle in der Karzinogenese und könnten als bisher unbekannte Bindeglieder zwischen IL-22 und der Entstehung und Metastasierung maligner Entartungen fungieren. Darüber hinaus könnte sich durch NNMT, ein Enzym, das vornehmlich in der Leber exprimiert wird, eine Verbindung zur Rolle von IL-22 bei Leberzirrhose ergeben. Zusammengefasst eröffnen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht nur neue Einblicke in die Biologie von IL-22, sondern auch potenzielle Ansätze zur Therapie diverser Erkrankungen. So ist denkbar, in der Behandlung IL-22 getriebener Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Psoriasis, auf die von starken Nebenwirkungen begleitete Verabreichung von CsA zu verzichten und stattdessen, beispielsweise durch Inhibierung des IKK-Komplexes, regulatorisch auf IL-22 einzuwirken. Neben einer möglichen Beteiligung von CEACAM5 und NNMT an IL-22/STAT3 vermittelter Karzinogenese, implizieren die hier vorgestellten Ergebnisse eine Funktion des Zytokins bei Borrelieninfektion und Leberzirrhose, wobei die genauen Aufgaben von IL-22 im Rahmen dieser Krankheitsbilder bislang unbekannt sind. Weitere Untersuchungen müssen klären, ob eine Modulation der IL-22 Spiegel für die Therapie der jeweiligen Erkrankungen in Frage kommen könnte. Zumindest bei Leberzirrhose könnte die IL-22 Serumkonzentration aufgrund der hier vorgelegten Ergebnisse allerdings jetzt schon als neuer prognostischer Marker herangezogen werden.

Auswirkungen der Koronarrevaskularisation am spontan atmenden, wachen Patienten auf die postoperative Vitalkapazität und Mobilisation (2011)

Stephanie Hüsch

In den letzten Jahren beobachtet man einen Kurs, der sich weg von invasiven zu minimal-invasiven Verfahren in der Bypasschirurgie bewegt. Neue Techniken ermöglichen einen weniger traumatischen Eingriff. Dazu zählen minimal-invasive Verfahren wie PUS- und LAST-OP. Ein besonderes Augenmerk gilt der ACAB-Operation. Während des gesamten Eingriffes ist der Patient wach und atmet spontan. Schmerzfreiheit wird über einen thorakalen PDK erlangt. In dieser Studie sollen die Gruppe ACAB bezüglich ihrer prä- und postoperativen Vitalkapazität, der Blutgasanalyse, bezüglich ihres Schmerzempfindens, der postoperativen Mobilität und hinsichtlich der Akzeptanz der OP-Technik untersucht bzw. mit PUS und LAST verglichen werden. 68 Patienten wurden zwischen Januar 2000 und August 2005 in die Studie aufgenommen und drei Operationsgruppen zugeteilt: ACAB (n = 26), PUS (n = 24) und LAST (n = 18). Von ihnen wurden präoperative und postoperative Lungenfunktionswerte (VC) am dritten postoperativen Tag und Blutgasanalysen (pO2 und sO2) eine, sechs und zwölf Stunden postoperativ erhoben. Mit Hilfe der Visuellen Analogskala wurden die Patienten zu festgesetzten Zeitpunkten zu ihrem Schmerzzustand befragt. Aussagen über den Mobilitätsgrad und Akzeptanz konnten mit Einsatz eines Fragebogens erzielt werden. In der ACAB-Gruppe zeigten sich postoperativ signifikant höhere Lungenvolumina und Normwerte in der Blutgasanalyse im Vergleich zu den Gruppen B und C. Signifikant niedriger gaben die Patienten der Gruppe A (ACAB) (31,8 +/− 5) im Vergleich zu B (PUS) (52,2 +/− 7,3) und Gruppe C (LAST) (61,6 +/− 5,8) Schmerzen an. Die höchsten Werte auf der VAS wurden in Gruppe C (LAST) angegeben. Mobil waren bereits am Operationstag 20 von 26 Patienten der ACAB-Gruppe. Nur 4 bzw. 3 Patienten der Vergleichsgruppen konnten ebenfalls mobilisiert werden. Die Akzeptanz des ACAB-Operationsverfahrens von Seiten der Patienten war hoch. 25 (96,1%) Patienten würden sich erneut wach operieren lassen. Es zeigte sich, dass weniger invasive Operationsmethoden und veränderte anästhesiologische Verfahren einen positiven Einfluss auf die Erholung des Patienten haben. Nach sorgfältiger Indikationsstellung stellen alle drei Methoden komplikationsarme Eingriffe dar. Der Verzicht auf die Allgemeinanästhesie wirkte sich besonders auf die Mobilisation, Lungenfunktion, BGA und damit auf die Rekonvaleszenz der Patienten aus. Ein Blick in die Zukunft lässt annehmen, dass sich dieses Verfahren in Zukunft im klinischen Alltag etablieren lässt.

Psychische und psychosomatische Morbidität, Komorbidität und psychologischer Behandlungsbedarf bei Patienten einer pädiatrisch-gastroenterologischen Ambulanz (2011)

Sebastian Becker

Mittels fragebogenbasierendem Screeningverfahren konnte bei 15,3% der Patienten der pädiatrisch gastroenterologischen Ambulanz der Darmstädter Kinderkliniken Prinzessin Margaret ein psychologischer bzw. psychosomatischer Beratungs- und Behandlungsbedarf ermittelt werden. Bei 40,3% der Patienten wurden grenzwertige Befunde erhoben, 44,4 % blieben unauffällig. Im Vergleich zwischen einer Klinik der I. bis II. Versorgungsstufe und einer universitären Klinik der III. Versorgungsstufe besteht ein gering signifikanter Unterschied, dabei ist der Anteil unauffälliger Ergebnisse mit 45,8% etwa gleich, es sind mit 21,4% jedoch wesentlich mehr Auffälligkeiten und mit 32,8% weniger grenzwertige Befunde zu verzeichnen. Begründet ist diese Differenz in der Stichprobenstruktur und den unterschiedlichen Versorgungsspektrum der Kliniken. Im Vergleich analoger Gruppen von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und chronischen Bauchschmerzen konnten keine signifikanten Unterschiede gemessen werden. Der größten Beratungsbedarf konnte in der Gruppe Patienten mit Adipositas ermittelt werden, in der universitären Klinik liegt der bei den Patienten mit Lebererkrankungen. Einen überdurchschnittlich hohen Beratungsbedarf findet man bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und bei Kindern- und Jugendlichen mit chronischen Bauchschmerzen mit und ohne Nachweis einer Kohlenhydratmalabsorption. Signifikante Unterschiede bestehen zwischen der Fremdbeurteilung durch die Eltern und Selbstbeurteilung der Jugendlichen im Strengths and Difficulties Questionnaire. In der Selbstbeurteilung finden sich 88,8% unauffällige, 6,4% grenzwertige und 4,8% auffällige Ergebnisse. In der Elternbeurteilung werden jeweils 14,4% der Kinder- und Jugendlichen als auffällig und grenzwertig bezüglich des Verhaltens bewertet, 71,2% erreichen Normwerte. Hinweise auf emotionale und Verhaltensauffälligkeiten fanden sich insbesondere bei adipösen Patienten, bei Kohlenhydratmalabsorptionen und bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. In der Gruppe der adipösen Jugendlichen fällt eine ausgesprochen negative Selbstbewertung auf. Die gesundheitsbezogenen Lebensqualität wird durch die Eltern in 50,7% der Fälle als eingeschränkt beurteilt. Nur 13,9% der Jugendlichen geben eine Einschränkung der subjektiven Gesundheit an. Führend in Fremdund Selbstbeurteilung sind Erkrankungen die eine spezifische Diät notwendig machen wie Nahrungsmittelunverträglichkeiten und Zöliakie. In der Selbstbeurteilung geben Patientin mit Adipositas und chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Einschränkung der subjektiven Gesundheit an, auffällig ist die wesentlich positivere Einschätzung der Situation durch die Eltern in diesen Gruppen. Schmerzen, Krankheitsaktivität, jugendliches Alter und später Zeitpunkt der Diagnosestellung beeinflussen die subjektive Gesundheit negativ. In der Behandlung chronisch kranker Kinder- und Jugendlicher in der pädiatrischen Gastroenterologie ist nicht nur bei Patienten mit funktionellen Bauchschmerzen oder Ausscheidungsstörung die interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Kindergastroenterologie und Psychosomatik bzw. Kinder- und Jugendpsychologie notwendig. Ein besonderes Augenmerk muss, neben den Patienten die stark durch Krankheitsaktivität oder Therapiemaßnahmen eingeschränkt sind, den übergewichtigen Jugendlichen gelten. Bei Fragebögen müssen Elternund Selbstbeurteilung beachtet werden, weitere Fremdbeurteilung durch die behandelnden Ärzte oder Lehrer können hilfreich sein. Neben dem kurativen Ziel bzw. der Remission muss die Therapie das Ziel haben, eine möglichst uneingeschränktes alltägliches Leben zu gewährleisen, das dem gleichaltriger, gesunder Kinder und Jugendlichen entspricht.

Osteopathia striata mit Schädelsklerosierung unter besonderer Berücksichtigung zahnmedizinischer Aspekte (2011)

Kathrin Christine Mehler

Die Osteopathia striata mit Schädelsklerosierung (OSCS) ist eine seltene Knochendysplasie, die durch die namensgebende lineare Streifung der langen Röhrenknochen, eine Sklerose des Schädels und seltenere Fehlbildungen anderer Organsysteme charakterisiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurden 3 Familien mit 9 betroffenen Familienmitgliedern untersucht und die Verläufe über teilweise 20 Jahre dokumentiert. Die Symptome wurden mit 55 gut dokumentierten Patienten aus der Literatur verglichen. Typisch sind ein Makrocephalus mit prominenter Stirn und Hypertelorismus, Hörstörungen, LKG-Spalten, und Herzfehler. Seltener sind Syndaktylie, Klinodaktylie, Polydaktylie und Kamptodaktylie, Klumpfüße und Spina bifida occulta. Fehlbildungen im Bereich der Luftwege und des Verdauungstraktes wurden vereinzelt beschrieben. Hirnnervenausfälle in Form von Facialisparesen oder partiellen Trigeminusparesen wurden nur in der Literatur beschrieben, aber bei keinem unserer Patienten. Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeit lag in der Dokumentation von Zahn- und Kieferfehlbildungen, Dysplasien sowie in Therapiemöglichkeiten. So hatten 66 % unserer Patienten dentale Positionsanomalien, 55 % eine Hypodontie durch fehlende oder verlagerte Zähne, während diese nur bei 18 % der Patienten aus der Literatur aufgeführt waren. Alle eigenen Patienten hatten einen gestörten physiologischen Zahnwechsel, so dass häufig Zähne extrahiert werden mussten, um einen Durchbruch, bzw. eine korrekte Einstellung der bleibenden Zähne zu erreichen. Neonatale Zähne und ein Mesiodens als Schwachform einer Holoprosenzephalie erweitern das bisherige dentale Spektrum der OSCS. Kieferorthopädische und kieferchirurgische Behandlungsmöglichkeiten werden diskutiert, wobei auch auf die Erfahrungen bei der Dysostosis cleidocranialis zurückgegriffen wurde, weil es bisher keine Konzepte zur Behandlung der OSCS gab. Mit Kieferdehiszensen nach kieferchirurgischer Behandlung muss aufgrund einer möglicherweise verminderten Osteogenese im sklerosierten Knochen gerechnet werden. Hypodontie, Zahnfehlstellungen und Zahndurchbruchsstörungen sind erste Symptome, die differentialdiagnostisch an eine OSCS denken lassen. Nur durch einen frühzeitigen und multidisziplinären Therapieansatz, der Kinderzahnarzt, Hauszahnarzt, Kieferorthopäde und Kieferchirurg umfasst, lassen sich die vielfältigen Probleme bei Patienten mit OSCS zufriedenstellend behandeln. Wegen der langen Behandlungsdauer ist es notwendig, früh, konsequent und eng Patienten und Eltern in die Behandlungsplanung mit einzubeziehen. Die OSCS wird X-gekoppelt dominant vererbt. Männer sind zumeist deutlich schwerer betroffen als Frauen. Ursache sind Mutationen im WTX-Gen (Wilms tumor gene on the X-chromosome; Locus: Xq11.1), die zu einer Haploinsuffizienz des Gens führen. WTX supprimiert direkt, bzw. indirekt über Axin den Wnt/ß-catenin Signalweg, der eine große Rolle bei verschiedenen Tumoren und Entwicklungsstörungen spielt. In die regel- und zeitgerechte Zahnentwicklung greift Wnt in mehreren Entwicklungsstufen ein. Die bei der OSCS vorliegenden Zahnfehlbildungen und Dysplasien können dadurch pathogenetisch erklärt werden.

Signaling by the matrix-proteoglycan decorin : effects on inflammation and apoptosis in cancer and diabetes (2011)

Rosetta Merline

Decorin, a small leucine rich proteoglycan (SLRP) of the extracellular matrix (ECM) is a biologically active molecule with signaling capabilities modulating diverse cellular functions 1. In this report, we explore the role of the matrix proteoglycan decorin in the regulation of inflammation and apoptosis and the resultant biological significance in cancer and diabetic nephropathy. The mechanisms linking immunity and inflammation with tumor development are not well defined. Here we report a novel finding that the soluble form of decorin could autonomously trigger the synthesis of TNFα and IL-12 in macrophages through TLR2 and TLR4 in a p44/42- and p38-dependent manner. In the presence of LPS, decorin enhanced the effects of LPS by signaling additionally via TLR2. Further, decorin could enhance PDCD4 protein expression with subsequent inhibition of LPS-mediated IL-10 protein synthesis by two mechanisms: i) by TLR2/TLR4-dependent stimulation of PDCD4 synthesis and ii) by inhibition of the TGFβ1-induced increase of miR-21, a posttranscriptional suppressor of PDCD4 protein synthesis. Enhanced PDCD4, a translational inhibitor of IL-10, downregulated this anti-inflammatory cytokine, thereby further driving the cytokine profile towards a proinflammatory phenotype. Importantly, these mechanisms appear to operate in a broad biological context linking pathogen-mediated with sterile inflammation as shown here for sepsis and growth retardation of established tumor xenografts. In sepsis, decorin is an early response gene evoked by inflammation and is markedly elevated in plasma of septic human patients and in plasma and tissues of septic mice. Our findings suggested that in vivo decorin alone mimics the effects of LPS by enhancing the plasma and tissue levels of pro-inflammatory TNFα, IL-12 and PDCD4 but when administered together with LPS, it potentiated the proinflammatory response of this PAMP by inhibiting active TGFβ1, miR-21 and hence the LPS mediated IL-10 production. In vivo, overexpression of decorin in tumor xenografts resulted in decorin/TLR2/4-driven synthesis of PDCD4, TNFα, IL-12 and decorin/TGFβ1/miR-21-mediated inhibition of PDCD4 suppression shifting the immune response to a pro-apoptotic and proinflammatory axis with strong anti-tumorigenic effects resulting in increased apoptosis and growth retardation of solid tumor. Thus, decorin signaling boosts inflammatory activity in sepsis and tumor. In contrast to the proinflammatory and proapoptotic role of decorin in tumor, decorin deficiency in diabetic kidneys led to enhanced apoptosis and increased mononuclear cell infiltration indicating that decorin might give rise to distinct biological outcomes depending on the cell type and biological context. Accordingly, in this study, we used a model of streptozotocin-induced diabetes type 1 in wild-type (Dcn+/+) and decorin-deficient- (Dcn-/-) mice to further elucidate the role of decorin in diabetic nephropathy. In this model, decorin was overexpressed in the mesangial matrix of the glomerulus and in the tubulointerstitium both at the mRNA and protein level in early stages of diabetic nephropathy which declined as the disease further progressed supporting the concept that decorin might act as a part of a natural response to hyperglycemia and to damage caused there from. These observations correlate with the data obtained in renal biopsies from patients at various stages of diabetic nephropathy 15, suggesting clinical relevance of our findings for the human disease. In the diabetic kidney, decorin deficiency was associated with: i) glomerular and tubular overexpression of p27Kip1 and enhanced proteinuria, ii) enhanced expression of TGFβ1 and CTGF resulting in increased accumulation of ECM, iii) overexpression of biglycan and elevated infiltration of mononuclear cells, iv) enhanced apoptosis of tubular epithelial cells despite overexpression of tubular IGF-IR. We further discovered that decorin binds to the IGF-IR in tubular epithelial cells and conveys protection against high glucose-mediated apoptosis providing evidence for a protective role of decorin during diabetic nephropathy development. Thus, future therapeutic approaches that would either enhance the endogenous production of decorin or deliver exogenous decorin to the diseased solid tumors and/or diabetic kidney might improve the prognosis of these chronic diseases.

Functional characterization of the Jumonji C domain-containing protein 6 (Jmjd6) in the vascular system (2011)

Jes-Niels Boeckel

Conclusion: Proteins containing a Jumonji C (JmjC) domain appear in almost all living organisms and catalyze a variety of oxidation reactions. Therefore, they are important regulators in many biological processes such as proliferation and differentiation. They act either as protein hydroxylases, histone demethylases or by regulate mRNA splicing. Given the fact that some of the JmjC domain-containing proteins are shown to be upregulated in response to hypoxia as well as the dependency of JmjC domain catalytic activity on oxygen led to the assumption of an involvement in angiogenesis. For Jmjd6, a member of the JmjC domain-containing protein family, a regulatory involvement in mRNA splicing has been shown. The Jmjd6-/- mouse dies perinatally due to several severe organ malformations, especially in the heart. Despite the pale appearance, the growth retardation and the cardiac defects, it is unclear whether these mice exhibit defects of cells comprising the vasculature. Therefore, the involvement of Jmjd6 in angiogenesis was examined in vitro using angiogenesis assays as well as in vivo using the Jmjd6+/- mouse. An siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs significantly impaired the formation of capillary-like networks in the tube formation assay as well as sprouting in the spheroid assay. Moreover, after siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 in ECs cell migration was significantly reduced. These findings were confirmed in the matrigel plug assay in vivo. Implanted matrigel plugs of Jmjd6+/- mice exhibited significantly less perfused vessels compared to wildtype littermates. Furthermore, cultured lung ECs from Jmjd6+/- mice exhibited impaired network forming activity ex vivo compared to cells isolated from wildtype littermates. To elucidate the mechanisms underlying the requirement of Jmjd6 in angiogenesis, an Affymetrix exon-array was performed, which allows detection of changes in gene expression as well as splicing. The siRNA-mediated knockdown of Jmjd6 altered the expression of genes known to play a role in vascular biology. The bioinformatic assessment of alternative splice variants revealed that Jmjd6 silencing affects the splicing of the VEGF receptor 1 (Flt1). Differential splicing of Flt1 was shown to generate a short and soluble form of Flt1 (sFlt1), which sequestrates VEGF and PlGF, and thereby inhibits angiogenesis. In particular, a significant increase in sFlt1 expression was observed. Jmjd6 was recently reported to hydroxylate the splicing factor U2AF65. Therefore, we investigated whether U2AF65 might mediate Flt1 splicing and binds to Flt1 mRNA. Indeed, U2AF65 co-immunoprecipitated with Jmjd6 in ECs, while an interaction of U2AF65 with sFlt1 was demonstrated. Moreover, inhibition of Jmjd6 catalytic function by reduced oxygen concentration altered splicing of Flt1 resulted in an increase of the sFlt1 splice variant. Finally, saturating concentrations of VEGF or PlGF or neutralizing antibodies against sFlt1 significantly reduced the inhibition of sprouting caused by Jmjd6 knockdown in vitro. Collectively, our results indicate that Jmjd6 has an essential role in the oxygen-dependent regulation of angiogenesis by controlling the splicing of Flt1 mRNA, thereby adjusting the generation of the anti-angiogenic short splice variant sFlt1. Several publications demonstrated a major importance for sFlt1 as a biomarker for many severe human diseases such as preeclampsia, sepsis, cancer, myocardial infarction as well as chronic heart failure. Therefore, the identification of the molecular mechanism behind the generation of sFlt1 might enable the development of new or more precise clinical markers for the diagnosis of the corresponding diseases. Furthermore, the discovery of the enzymes involved in the generation of sFlt1 provides further possibilities to modulate sFlt1 levels and thereby may potentially gives rise to the development of new therapies.

Inhibierung der leukämischen Funktion des Fusionsproteins AML1/ETO durch Interferenz mit der Oligomerisierungsdomäne (2011)

Yvonne Becker

Das onkogene Fusionsprotein AML1/ETO entsteht durch die chromosomale Translokation t(8;21), die in etwa 12 % aller primären akuten myeloischen Leukämien (AML) auftritt. Die DNA-Bindedomäne des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors AML1 wird hierbei mit fast dem gesamten ETO-Protein fusioniert, das als transkriptioneller Repressor wirkt. In den transformierten Zellen kommt es somit zur Blockierung der myeloischen Differenzierung und zur verstärkten Proliferation. Entscheidend für das leukämische Potential von AML1/ETO ist die Fähigkeit zur Oligomerisierung, die durch die Nervy-Homologie-Region-2 (NHR2)-Domäne im ETO-Anteil vermittelt wird. Durch lentivirale Transduktion konnte bereits gezeigt werden, dass Proteine, welche die NHR2-Domäne enthalten, die Oligomerisierung von AML1/ETO inhibieren und damit den leukämischen Phänotyp AML1/ETO-exprimierender myeloischer Zellen aufheben. In der vorliegenden Arbeit sollten nun alternative Wege zur Einbringung der therapeutischen Proteine in t(8;21)-positive AML-Zellen untersucht werden. Dafür wurde sowohl die Möglichkeit der Proteintransduktion als auch die Verwendung nicht-integrierender viraler Vektoren analysiert. Im ersten Projekt wurden durch Fusion mit der HIV-1 TAT-Domäne zellpermeable NHR2-Proteine generiert. Zunächst wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine etabliert. Durch eine ausführliche biochemische Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass die aus Bakterien aufgereinigten NHR2-Proteine funktionell und sehr rein waren. Sie wiesen den erwarteten hohen alpha-helikalen Anteil auf und behielten ihre Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren in vitro bei. Die TAT-NHR2-Fusionsproteine sind in der Lage, in humane Zellen einzudringen und konnten erfolgreich in den Lysaten nachgewiesen werden. Mikroskopische Studien zeigten, dass der Großteil der internalisierten Proteine in Endosomen-ähnlichen Vesikeln lokalisiert war. Die Zugabe des Endosomeninhibitors Chloroquin oder eines endosomolytischen, zellpermeablen Peptides ermöglichte eine erhöhte intrazelluläre Stabilität der zellpenetrierenden Proteine. Co-Immunpräzipitations-Experimente konnten bestätigen, dass die aufgenommenen NHR2-Proteine spezifisch an das ETO-Protein in transfizierten, adhärenten Zellen binden können. Die Proteintransduktion in die myeloische, AML1/ETO-wachstumsabhängige Zelllinie Kasumi-1 ist unter serumfreien Bedingungen ebenfalls möglich. Die konsekutive Behandlung der AML-Zellen mit den TAT-NHR2- Fusionsproteinen führte zu einer Reduktion der Expression des Stammzellmarkers c-kit (CD117) in 26 % der behandelten Zellen. Die Anwendung zellpermeabler NHR2-Proteine ist demnach prinzipiell möglich, bedarf aber weiterer Optimierung, um die notwendige hohe Bioverfügbarkeit zu erreichen. In einem zweiten Projekt wurden Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet, um die NHR2-Proteine in den hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Mit Hilfe mehrerer Methoden konnte gezeigt werden, dass sich mit den generierten Vektoren, die auf dem AAV- Serotyp 2 basierten, erfolgreich eine transiente Genexpression induzieren ließ. Der CMV- Promoter vermittelte jedoch nur eine schwache Expression in den hämatopoetischen Zellen. Unter Verwendung des stärkeren SFFV-Promoters konnte die Expressionsstärke deutlich gesteigert werden. Die von den optimierten AAV-Vektoren vermittelte Expression der NHR2- Proteine führte in den beiden AML1/ETO-positiven Zelllinien Kasumi-1 und SKNO-1 zu den erwarteten, spezifischen Effekten. So wurde das Wachstum verlangsamt und gleichzeitig die Apoptoserate erhöht. AML1/ETO-unabhängige Zellen wurden dagegen von den AAV-NHR2- Vektoren nicht beeinflusst. Obwohl die Proteinexpression in SKNO-1 Zellen stärker war, zeigten die Kasumi-1 Zellen deutlichere Effekte. Die NHR2-Proteine bewirkten in den transduzierten t(8;21)-positiven Zellen außerdem eine Reduktion der Expression der Stammzellmarker CD34 bzw. c-kit. Dies deutet auf eine partielle Differenzierung der beiden AML1/ETO-abhängigen Zelllinien hin. Damit ließen sich durch AAV-vermittelte Transduktion in den AML-Zellen dieselbe Wirkung in Hinblick auf Wachstum, Differenzierbarkeit und Apoptoserate erzielen wie dies mit den lentiviralen Vektoren zuvor beschrieben wurde. In einem abschließenden Vergleich wurde aber deutlich, dass nicht-integrierende Vektorsysteme generell eine schwächere NHR2-Proteinexpression induzieren und demzufolge auch schwächere Effekte als integrierende Vektoren in den AML1/ETO-positiven Zellen auslösen.

Method developments in coupling gel electrophoresis with mass spectrometry (2011)

Dimitrios George Papasotiriou

Proteomic analysis is the large-scale identification and characterization of proteins including post translational modifications. Proteomics encompasses a number of approaches including bottom-up and top-down workflows which are widely used independently and complementary as tools for the successful study of protein species. However, up to the present day these techniques have not been able to overcome every analytical limitation. Mass spectrometry has played a vital role alongside proteomics in providing the required analytical means of detecting protein amounts down to the atomole range. Soft ionization methods such as matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI) and electrospray ionization (ESI) have permitted the transfer of peptides and intact proteins into the gas phase without extensive degradation. The introduction of recent developments in MALDI technology such as the highly sensitive 4-chloro-alpha-cyanocinnamic acid matrix (Cl-CCA) as well as the commercial availability of a MALDI-LTQ-Orbitrap which boosts peptide mass accuracy below 3 parts per million (ppm), have offered new prospective in protein analysis. The aim of the current study is to incorporate these new aspects and provide further advancements in gel-based as well as gel-free proteomic workflows. Peptides of proteolytically digested proteins are routinely analyzed by means of peptide mass fingerprinting (PMF) often combined with MS/MS analyses to complement and substantiate PMF results by peptide sequence information. The most widely used protease for enzymatic digestion is trypsin, since it exhibits a very specific cleavage behavior limited to C-terminal hydrolyses after basic amino acids. However, less specific enzymes such as chymotrypsin, elastase and pepsin have emerged as useful tools in the analysis of particular protein classes e.g. membrane, cereal, and phosphorylated proteins. In this work a comprehensive bottom-up proteomic investigation including in-solution and in-gel protein digestions of analytes covering small to large, acidic to basic, and hydrophobic to hydrophilic proteins in combination with a series of less specific enzymes are presented in order to show the superiority of the novel MALDI matrix Cl-CCA. The Cl-CCA matrix proved to be highly superior compared to standard α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) since an average detection of more than 2- to 3-fold peptide amount was possible depending on the used protease and, therefore, resulting in strongly increased sequence coverage. Additionally, protein identification of chymotrypsin and elastase in-gel digested protein standards was evaluated. The MALDI-LTQ-Orbitrap providing peptide mass accuracy below and up to 3 ppm in combination with Cl-CCA as matrix and newly optimized digestion conditions led to unambiguous protein identifications of all chymotryptic digests outperforming its tryptic counterparts in the case of hydrophobic bacteriorhodopsin and α-globin from hemoglobin A (α-HgbA). In addition, significantly higher sequence coverage and increased number of detected peptides was acquired. Moreover, a proposed workaround for elastase digestions was capable of providing a solution for successful identification results. Apart from digestions of singly separated proteins, solution isoelectic focusing (sIEF) was evaluated. OFFGEL fractionation is an efficient means of fractionating peptides and proteins according to their isoelectric point (pI) values through immobilized pH gel (IPG) strips after which samples are recovered in solution. Consequently, an issue of peptide recovery arises as a category of peptides relatively insoluble to the recovery solution should be present. A method was developed including the scraping of gel matrix from the IPG strips and peptide extraction using acetonitrile as organic solvent in combination with analytical techniques such as nLC-MALDI-MS/MS for peptide identification. The nature of the peptide species remaining in-gel was analysed and attributed to peptide solubility. A general trend in which a high percentage of neutral and hydrophobic peptides remaining entrapped in the IPG gel strip was observed. The present work also examines a new top-down proteomic workflow involving protein elution from cleavable gels containing the labile crosslinker ethylene-glycol-diacrylate (EDA). Protein amounts of as low as 100 ng loaded onto EDA gels were detected using MALDI-TOF MS in the linear acquisition mode. Proteins from 8.5 up to 78 kDa were successfully measured including a hydrophobic 15 kDa core protein attaining a GRAVY score of +0.079. Additionally, the method was compatible with one dimensional protein separation as well as for 2-D IEF/SDS-PAGE. Lastly, two methods for protein identification were tested and found to be compatible to the proposed technique.

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