OPUS 4 | Biochemie und Chemie

Expression und Charakterisierung des Parvulustat Proteins und seinen Derivaten (2010)

Alma Sokočević

Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus, das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert: · Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen, dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0 und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt. In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur, was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al., Theoretischer Teil -4- 2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur. · Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm: 79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA weist eine leicht verringerte Aktivität auf. Tabelle 2.1: ... Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung des Parvulustats Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b- Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen. Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen. · Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A, P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1). Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten. Theoretischer Teil -6- Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt. · Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden. Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes 70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle 70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt. Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die Proteinstabilität zu bekommen. Theoretischer Teil -7- Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus (Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions- Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.

Ordnung des Fachbereichs Biochemie, Chemie, Pharmazie der Johann Wolfgang Goethe-Universität für den Bachelorstudiengang Biochemie mit dem Abschluss „Bachelor of Science“ (B. Sc.) vom 07.06.2010 : vorläufig genehmigt vom Präsidium der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am 27.07.2010 (2010)

Kernel learning for ligand-based virtual screening:discovery of a new PPARgamma agonist (2010)

Matthias Rupp Timon Schroeter Ramona Steri Ewgenij Proschak Katja Hansen Heiko Zettl Oliver Rau Manfred Schubert-Zsilavecz Klaus-Robert Müller Gisbert Schneider

Poster presentation at 5th German Conference on Cheminformatics: 23. CIC-Workshop Goslar, Germany. 8-10 November 2009 We demonstrate the theoretical and practical application of modern kernel-based machine learning methods to ligand-based virtual screening by successful prospective screening for novel agonists of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) [1]. PPARgamma is a nuclear receptor involved in lipid and glucose metabolism, and related to type-2 diabetes and dyslipidemia. Applied methods included a graph kernel designed for molecular similarity analysis [2], kernel principle component analysis [3], multiple kernel learning [4], and, Gaussian process regression [5]. In the machine learning approach to ligand-based virtual screening, one uses the similarity principle [6] to identify potentially active compounds based on their similarity to known reference ligands. Kernel-based machine learning [7] uses the "kernel trick", a systematic approach to the derivation of non-linear versions of linear algorithms like separating hyperplanes and regression. Prerequisites for kernel learning are similarity measures with the mathematical property of positive semidefiniteness (kernels). The iterative similarity optimal assignment graph kernel (ISOAK) [2] is defined directly on the annotated structure graph, and was designed specifically for the comparison of small molecules. In our virtual screening study, its use improved results, e.g., in principle component analysis-based visualization and Gaussian process regression. Following a thorough retrospective validation using a data set of 176 published PPARgamma agonists [8], we screened a vendor library for novel agonists. Subsequent testing of 15 compounds in a cell-based transactivation assay [9] yielded four active compounds. The most interesting hit, a natural product derivative with cyclobutane scaffold, is a full selective PPARgamma agonist (EC50 = 10 ± 0.2 microM, inactive on PPARalpha and PPARbeta/delta at 10 microM). We demonstrate how the interplay of several modern kernel-based machine learning approaches can successfully improve ligand-based virtual screening results.

The C-terminus of p63 contains multiple regulatory elements with different functions (2010)

Wesley E. Straub Tobias Alexander Weber Birgit Schäfer Eleonora Candi Florian Durst Horng Der Ou Krishnaraj Rajalingam Gennaro Melino Volker Dötsch

The transcription factor p63 is expressed as at least six different isoforms, of which two have been assigned critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology on the one hand and supervision of the genetic stability of oocytes on the other hand. These two isoforms contain a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates their transcriptional activity. This inhibitory domain contains two individual components: one that uses an internal binding mechanism to interact with and mask the transactivation domain and one that is based on sumoylation. We have carried out an extensive alanine scanning study to identify critical regions within the inhibitory domain. These experiments show that a stretch of ~13 amino acids is crucial for the binding function. Further, investigation of transcriptional activity and the intracellular level of mutants that cannot be sumoylated suggests that sumoylation reduces the concentration of p63. We therefore propose that the inhibitory function of the C-terminal domain is in part due to direct inhibition of the transcriptional activity of the protein and in part due to indirect inhibition by controlling the concentration of p63. Keywords: p63, transcriptional regulation, auto-inhibition, sumoylation

Development of target specific and preparative scale cell-free expression protocols in combination with automated screening purposes : studies on transporters and G-protein coupled receptors (2010)

Daniel Schwarz

Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.

Protein-Protein Interaktionen der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I) aus Yarrowia lipolytica (2010)

Esther Annegrit Gina Nübel

Protein-Protein Interaktionen der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Kolmplex I) aus Y. lipolytica In der inneren Mitochondrienmembran sind die Atmungskettenkomplexe I bis IV und die ATP-Synthase lokalisiert. Parallel zum Elektronentransport werden Protonen von der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I), der bihydrochinon:Cytochrom c-Oxidoreduktase (Komplex III) und der Cytochrom c-Oxidase (Komplex IV) über die Membran in den Intermembranraum gepumpt. Der resultierende chemiosmotische Gradient wird von der ATPase verwendet um ATP zu generieren. Die NADH:Ubichinon- xidoreduktase ist der Startpunkt des Elektronentransfers. Der Komplex I wurde in verschiedenen Organismen in Interaktion mit Komplex III und IV beobachtet. Diese funktionellen Einheiten werden als Respirasomen oder Superkomplexe bezeichnet (Pfeiffer und Schägger, 2000). Der Komplex I in prokaryotischen Zellen stellt die kleinstmögliche Variante dieses Enzyms dar. Da er in der Lage ist, alle bioenergetischen Reaktionen durchzuführen, werden die beteiligten 14 Untereinheiten als zentrale Untereinheiten bezeichnet (Fearnley et al. 1992). In den Eukaryoten findet sich ein Enzym, das je nach Organismus bis zu 31 weitere, sogenannte akzessorische Untereinheiten aufweist. Da diese Untereinheiten keine Homologie mit bakteriellen Proteinen aufweisen, wird davon ausgegangen, dass sie eher eine Funktion im Assemblierungsprozess ausüben als am Elektronentransfer oder der Translokation der Protonen beteiligt zu sein. Ziel dieser Arbeit war es daher mögliche Interaktionspartner des Komplex I oder weitere Untereinheiten zu finden. Für die Detektion möglicher Interakteure sollten neben einem Two-Hybrid-Screen noch weitere Methoden etabliert werden. Als Modellsystem wurde Yarrowia lipolytica verwendet. Unter Verwendung des BacterioMatchII® Systems konnte die mitochondriale Malat-Dehydrogenase, ein Enzym des Citrat-Zyklus, als ein Interaktionspartner des Komplex I gefunden werden. Bei der Reaktion entsteht NADH, das Energieäquivalent, welches dem Komplex I Elektronen liefert. Im Kontext des Substratchannelings deutet die Interaktion der mitochondrialen Malat- ehydrogenase auf hochgeordnete Stukturen im Matrixraum hin, die einen Transfermechanismus oder eine zielgerichtete Diffusion des NADH gewährleisten könnten. Durch die Kombination der Methoden Immunpräzipitation, Gelelektrophorese und MALDI-MS konnten erstmals Hinweise auf Superkomplexe in Y. lipolytica gefunden werden, was dann durch mehrdimensionale Gelelektrophorese bestätigt werden konnte. In dieser Arbeit konnten die Superkomplexe I1III2 ,I1III2IV1 und I1III2IV2 identifiziert werden. Ein vollständiges Respirasom mit einer Stöchiometrie von I1III2IV4 konnte nicht gezeigt werden. Desweiteren konnte die Anwesenheit eines Komplex I-Dimers nachgewiesen werden. In dem bisher postulierten Modell der respiratory strings werden die Superkomplexe durch tetramere Komplex IV-Module zu hochmolekularen Strukturen verknüpft (Wittig et al., 2006). Die detektierten Komplex I-Dimere lassen vermuten, dass sie zusammen mit dem tetrameren Komplex IV als Linker-Moleküle die Superkomplexe zu einem zweidimensionalen respiratory patch verbinden. Zudem konnte eine neue Untereinheit des Komplex I, genannt NEBM, durch das Zusammenspiel von LILBID- und MALDI-Massenspektrometrie und Gelelektophorese identifiziert werden. Durch MALDI-Massenspektrometrie wurde diese Untereinheit de novo sequenziert. Die Charakteristik des identifizierten Proteins entspricht den sogenannten single-transmembrane domain Untereinheiten (Brandt et al., 2005; Brandt 2006), die eventuell eine Funktion in der Assemblierung des Komplex I einnehmen könnten. Weder bei den Messungen der NADH:HAR- noch der dNADH:DBQ-Aktivität zeigte der Deletionsstamm enzymatisch aktiven Komplex I. Weder in blau-nativer Elektrophorese noch in silbergefärbten 2D SDS-Gelen war ein Komplex I noch ein Subkomplex sichtbar und auch In-Gel-Aktivitäts-Tests verliefen für die Detektion von Komplex I im Deletionsstamm negativ. Erst durch eine Western Blot Analyse konnte ein Subkomplex mit einer Größe von ca. 300kDa detektiert werden. Unter Berücksichtigung der für den Rinderkomplex vorgeschlagenen Einteilung des Komplex I in die Subkomplexe Iα und Iβ (Brandt et al. 2006) könnte der detektierte Subkomplex Iβ zugeordnet werden, da er zwei Untereinheiten beinhaltet, die diesem Komplex zuzuordnen sind. Die NEBM Untereinheit könnte also an der Assemblierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase beteiligt sein. Erstmals konnten Superkomplexe in Y. lipolytica Mitochondrien nachgewiesen werden. Die Identifizierung der neuen NEBM Untereinheit vervollständigt die Kenntnisse über die Untereinheitenzusammensetzung. Das Wechselspiel mit anderen Proteinen und die Zusammensetzung des Komplexes können für die Strukturaufklärung und zur Analyse des Reaktionsmechanismus wichtig sein. Somit leisten diese Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus Y. lipolytica.

SBE13, a newly identified inhibitor of inactive polo-like kinase 1 (2010)

Sarah Keppner Ewgenij Proschak Gisbert Schneider Birgit Spänkuch

Poster presentation at 5th German Conference on Cheminformatics: 23. CIC-Workshop Goslar, Germany. 8-10 November 2009 Protein kinases are important targets for drug development. The almost identical protein folding of kinases and the common co-substrate ATP leads to the problem of inhibitor selectivity. Type II inhibitors, targeting the inactive conformation of kinases, occupy a hydrophobic pocket with less conserved surrounding amino acids [1]. Human polo-like kinase 1 (Plk1) represents a promising target for approaches to identify new therapeutic agents. Plk1 belongs to a family of highly conserved serine/threonine kinases, and is a key player in mitosis, where it modulates the spindle checkpoint at metaphase/anaphase transition. Plk1 is over-expressed in all today analyzed human tumors of different origin and serves as a negative prognostic marker in cancer patients. The newly identified inhibitor, SBE13, a vanillin derivative, targets Plk1 in its inactive conformation [2]. This leads to selectivity within the Plk family and towards Aurora A. This selectivity can be explained by docking studies of SBE13 into the binding pocket of homology models of Plk1, Plk2 and Plk3 in their inactive conformation. SBE13 showed anti-proliferative effects in cancer cell lines of different origins with EC50 values between 5 microM and 39 microM and induced apoptosis. Increasing concentrations of SBE13 result in increasing amounts of cells in G2/M phase 13 hours after double thymidin block of HeLa cells. The kinase activity of Plk1 was inhibited with an IC50 of 200 pM. Taken together, we could show that carefully designed structure-based virtual screening is well-suited to identify selective type II kinase inhibitors targeting Plk1 as potential anti-cancer therapeutics.

Elektrophysiologische Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 mit Hilfe der SSM-Technik (2010)

Patrick Schulz

Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.

Identifizierung von CbaX : in Biogenesefaktor für die Cytochrom-ba_1tn3-Oxidase aus Thermus thermophilus (2010)

Carolin Werner

Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.

Investigation of three accessory subunits of complex I from Yarrowia lipolytica (2010)

Krzysztof Dobrynin

The nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH):ubiquinone oxidoreductase (complex I) from the strictly aerobic yeast Y. lipolytica contains at least 26 “accessory” subunits however the significance of most of them remains unknown. The aim of this study was to characterize the role of three accessory subunits of complex I, recently identified: two mitochondrial acyl carrier proteins, ACPM1 and ACPM2 and a sulfurtransferase (st1) subunit. ACPMs are small (approx. 10 kDa) acidic proteins that are homologous to the corresponding central components of prokaryotic fatty acid synthase complexes. Genomic deletions of the two genes ACPM1 and ACPM2 resulted in strains that were not viable or retained only trace amounts of assembled mitochondrial complex I, respectively, as assessed using two-dimensional blue native/sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (BN/SDS) PAGE. This suggested different functions for the two proteins that despite high similarity could not be complemented by the respective other homolog still expressed in the deletion strains. To test whether complex I was affected by deletion of the ACPM2 gene, its activities in mitochondrial membranes were measured. Consequently, specific inhibitor sensitive dNADH: decylubiquinone (DBQ) oxidoreductase activity was lost completely and a strong decrease in dNADH: hexa-ammine-ruthenium (HAR) oxidoreductase activity was measured. Remarkably, the same phenotypes were observed if just the conserved serine carrying the phosphopantethein moiety was exchanged with alanine. Although this suggested a functional link to the lipid metabolism of mitochondria, using HPLC chromatography no changes in the lipid composition of the organelles were found. Proteomic analysis revealed that both ACPMs were tightly bound to purified mitochondrial complex I. Western blot analysis revealed that the affinity tagged ACPM1 and ACPM2 proteins were exclusively detectable in mitochondrial membranes but not in the mitochondrial matrix as reported for other organisms. Hence it has been concluded that the ACPMs can serve all their possible functions in mitochondrial lipid metabolism and complex I assembly and stabilization as subunits bound to complex I. A protein exhibiting rhodanese (thiosulfate:cyanide sulfurtransferase) activity was found to be associated with homogenous preparation of complex I. From a rhodanese deletion strain, functional complex I that lacked the additional protein but was fully assembled and displayed no functional defects or changes in EPR signature was purified. In contrast to previous suggestions, this indicated that the sulfurtransferase associated with Y. lipolytica complex I is not required for assembly of its iron–sulfur clusters.

Biochemie und Chemie

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