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HuR promotes tumorigenic characteristics in hepatocellular carcinoma (2012)

Kathrin Schulz

In the absence of apparent mutations, alteration of gene expression patterns represents the key mechanism by which normal cells evolve to cancer cells. Gene expression is tightly regulated by posttranscriptional processes. Within this context, RNA-binding proteins (RBPs) represent fundamental factors, since they control mechanisms, such as mRNA-stabilization, -translation and -degradation. Human antigen R (HuR) was among the first RBPs that have been directly associated to carcinogenesis. HuR modulates the stability and translation of mRNAs which encode proteins facilitating various ‘hallmarks of cancer’, namely proliferation, evasion of growth suppression, angiogenesis, cell death resistance, invasion and metastasis. Furthermore, it is well established that tumor-promoting inflammation contributes to tumorigenesis. In this process, monocytes are attracted to the site of the tumor and educated towards a tumor-promoting macrophage phenotype. While HuR has been extensively studied in various tumor cell types, little is known about HuR in hepatocellular carcinoma (HCC). Thus, the aim of my work was to characterize the contribution of HuR to the development of cancer characteristics in HCC. I was particularly interested to investigate if HuR facilitates tumor-promoting inflammation, since a role for HuR has not been described in this context. To this end, I depleted HuR in HepG2 cells (HuR k/d) and used a co-culture model of HepG2 tumor spheroids and infiltrating monocytes to study the impact of HuR on the tumor microenvironment. I could show that depletion of HuR resulted in the reduction of cell numbers. Additionally, the expression of proliferation marker KI-67 and proto-oncogene c-Myc was reduced, supporting a proliferative role of HuR. Furthermore, exposure to cytotoxic staurosporine elevated apoptosis in HuR k/d cells compared to control cells. Concomitantly, the expression of the anti-apoptotic mediator B-cell lymphoma protein-2 (Bcl-2) was markedly reduced in the HuR k/d cells, pointing to an involvement of HuR in cell survival processes. Accordingly, a pro-survival function of HuR was also observed in tumor spheroids, since HuR k/d spheroids exhibited a larger necrotic core region at earlier time points and showed elevated numbers of dead cells compared to control (Ctr.) spheroids. Interestingly, HuR k/d spheroids isplayed reduced numbers of infiltrated macrophages, suggesting that HuR contributes to a tumor-promoting, inflammatory microenvironment by recruiting monocytes/macrophages to the tumor site. Aiming at identifying HuR-regulated factors responsible for the recruitment of monocytes, I found reduced levels of the chemokine interleukin 8 (IL-8) in supernatants of HuR k/d spheroids, supporting a critical involvement of HuR in the chemoattraction of monocytes. Analyzing supernatants of co-cultures of macrophages and HuR k/d or Ctr. spheroids revealed additional differences in chemokine secretion patterns. Interestingly, protein levels of many chemokines were elevated in co-cultures of HuR k/d spheroids compared to control co-cultures. Albeit enhanced chemokine secretion was observed, less monocytes are recruited into HuR k/d spheroids, further underlining the necessity of HuR in cancer related monocyte/macrophage attraction and infiltration. Differences between chemokine profiles of mono- and co-cultured spheroids could be attributable to changes in spheroid-derived chemokines as a result of the crosstalk with the immune cells. Provided the chemokines originate from monocytes/macrophages, the different secretion patterns suggest that HuR contributes to the modulation of the functional phenotype of infiltrated macrophages, since the tumorenvironment is critically involved in the shaping of macrophage phenotypes. Regions of low-oxygen (hypoxia) represent another critical feature of tumors. Therefore, I next analyzed the impact of HuR on the hypoxic response. Loss of HuR attenuated hypoxia-inducible factor (HIF) 2α expression after exposure to hypoxia, while HIF-1α protein levels remained unaltered. Considering previous results of our group, showing that HIF-2α depletion (HIF-2α k/d) resulted in the enhanced expression of HIF-1α protein, I aimed to determine the involvement of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α protein in HIF-2α k/d cells. I could demonstrate that not only total HuR protein levels, but specifically cytoplasmic HuR was elevated in HIF-2α depleted cells pointing to enhanced HuR activity. Silencing HuR in HIF-2α deficient cells attenuated enhanced HIF-1α protein expression, thus confirming a direct role of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α. This as also reflected on HIF-1α target gene expression. I further investigated the mechanism underlying the compensatory HIF-1α expression in HIF-2α deficient cells. Analyzing HIF-1α mRNA expression, I excluded enhanced HIF1-α transcription and stability to account for elevated HIF-1α expression in HIF-2α k/d cells. HIF-1α promoter activity assays confirmed the mRNA data. Furthermore, HIF-1α protein half-life was not elevated in HIF-2α k/d cells compared to control cells, indicating that HIF-1α protein stability is not altered in HIF-2α k/d cells. Analysis of the association of HIF-1α with the translational machinery using polysomal fractionation finally revealed an increased istribution of HIF-1α mRNA in the heavier polysomal fractions in HIF-2α k/d cells compared to control cells. Since augmented ribosome occupancy is an indicator for more efficient translation, I propose enhanced HIF-1α translation as underlying principle of the compensatory increase in HIF-1α protein levels in HIF-2α k/d cells. In summary, my results demonstrate that HuR is critical for the development of cancer characteristics in HCC. Future work analyzing the impact of HuR on tumor-promoting inflammation, specifically macrophage attraction and activation could provide new trategies to inhibit macrophage-driven tumor progression. Furthermore, I provide evidence that HuR contributes to the hypoxic response by regulating the expression of HIF-1α and HIF-2α. Targeting single HIF-isoforms for tumor therapy should be carefully considered, because of their compensatory regulation when one α-subunit is depleted. Thus, therapeutic strategies targeting factors such as HuR that control both α-subunits and at the same time prevent compensation might be more promising.

Dynamic nuclear polarization for magnetic resonance imaging : an in-bore approach (2012)

Jan G. Krummenacker

Nuclear Magnetic Resonance ("NMR") is a powerful and versatile technique relying on nuclei that posses a spin. Since its discovery more than 6 decades ago, NMR and related techniques has become a tool with innumerable applications throughout the fields of Physics, Chemistry, Biology and Medicine. Numerous Nobel Prizes have been awarded for work in the field and a multi billion dollar industry has developed on its basis. One of NMR's major shortcomings is its inherent lack of sensitivity. Because it relies on the Boltzmann populations of spin states with a minuscule Zeeman splitting, this is particularly true for room temperature experiments. As a result, in an enormous technological effort to enlarge the Zeeman splitting NMR magnets have been moving to higher and higher magnetic fields. However, even for proton spins possessing the largest magnetic moment of all nuclei, the degree of polarization that can be achieved in the strongest spectroscopic magnets available today (~24 T) at room temperature is merely ~ 8*(10 exp (-5)). In other words, this low polarization theoretically allows a sensitivity enhancement of 104 towards full polarization. Since Magnetic Resonance Imaging ("MRI") is based on the same principle, it shares this problem with NMR. Furthermore, for technical and physiological reasons full body MRI tomographs do not reach the magnetic field strengths of spectroscopic NMR magnets, making this even more of an issue for MRI. In consequence, MRI is chiefly restricted to detecting protons, while both MRI and NMR detection of 13C (or other low nuclei) under physiological conditions, i.e. low natural abundance of 13C and a low concentration of the respective substance, suffer from long acquisitions times that are necessary to obtain adequate signal to noise ratios ("SNR"). However, this drawback of NMR can be overcome. The enormous potential sensitivity increase of four orders of magnitude can - at least partially - be exploited by several hyperpolarization techniques, creating entirely new applications and fields of research. These hyperpolarization techniques comprise chemical approaches like Parahydrogen Induced Polarization ("PHIP") or Photochemically Induced Dynamic Nuclear Polarization ("Photo-CIDNP"), as well as physical techniques like optically pumped (noble) gases13, 14 or Dynamic Nuclear Polarization ("DNP"), which will be the focus of this work. A hyperpolarized substance will render a larger signal without being physically or chemically altered in any other way. It is therefore "marked" without any marker, making it an agent free contrast agent for MRI. DNP is a technique, in which hyperpolarization of nuclear spins is achieved by microwave (\MW") irradiation of unpaired electron spins in radicals, which are coupled to these nuclei, e.g. 1H, 13C or 15N. The electron spin population is perturbed if the microwave irradiation is resonant with the electron spin transition, which affects the polarization of hyperfine-coupled close nuclei. For large microwave power (i.e. saturating the electron spin transition) the orders of magnitude larger thermal electron spin polarization is effectively transferred to these nuclear spins in the sample. For proton spins the maximum polarization gain amounts to 660, whereas for 13C the sensitivity gain can be as large as 2600. In contrast to e.g. PHIP, which is restricted to specific reaction precursors, DNP is not limited to specific nuclei or hyperpolarization target molecules, making it a very versatile technique. DNP has been first proposed by Overhauser in 1953,15 and experimentally observed shortly thereafter in metals16 and liquids,17 both being systems with mobile electrons. In the 1960s and 70s, DNP was used as a spectroscopic tool in liquids, thoroughly mapping the effect in the low field regime. As well, several other transfer mechanisms were discovered, which are active in the solid state with localized electrons, namely the solid effect the cross effect and thermal mixing. The theory for all three of these mechanisms predicts reduced transfer efficiencies at higher magnetic fields. This fact and the lack of high frequency microwave sources to excite electron spins at magnetic field strengths above 1 T, effectively relegated DNP to a position of an interesting scientifi curiosity. In the early 1990s, DNP came to a renaissance, when DNP was performed at high field in solid state magic angle spinning ("MAS") experiments using high power gyrotron microwave sources. This pioneering work sparked a surge of new developments and applications. As well, this success triggered attempts to investigate also the potential of DNP in the liquid state at high magnetic fields, e.g. at 3.4 T35{38 and 9.2 T. To date, DNP can be considered one of the "hot topics" in the field of magnetic resonance, bringing about special issue in magnetic resonance journals and DNP sections on magnetic resonance conferences. This thesis deals with the development of an in-bore liquid state DNP polarizer for MRI applications operating in ow through mode at a magnetic field strength of 1.5 T. Following this introductory chapter, the theoretical background necessary to understand and interpret the experimental results is explained in chapter 2. Subsequently, chapter 3 deals with the issue of performing liquid state DNP at high magnetic fields and its challenges. The chapter comprises a quick overview of the necessary hardware, the experimental findings for various samples and the interpretation of these findings. along with the ramifications for the aim of this work. Chapter 4 deals with the issue of increasing sensitivity and contrast in MRI, in particular by means of DNP. The chapter illustrates the development of our polarizer by presenting the hardware that was developed and demonstrating its performance under various conditions. As well, several alternative approaches are introduced and compared to our approach. Finally, chapter 5 summarizes the findings and gives an outlook on further developments.

Expression und Charakterisierung des Parvulustat Proteins und seinen Derivaten (2010)

Alma Sokočević

Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus, das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert: · Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen, dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0 und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt. In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur, was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al., Theoretischer Teil -4- 2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur. · Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm: 79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA weist eine leicht verringerte Aktivität auf. Tabelle 2.1: ... Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung des Parvulustats Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b- Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen. Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen. · Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A, P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1). Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten. Theoretischer Teil -6- Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt. · Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden. Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes 70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle 70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt. Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die Proteinstabilität zu bekommen. Theoretischer Teil -7- Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus (Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions- Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.

NMR-spektroskopische Methodenentwicklung an RNA und strukturelle Charakterisierung des transkriptionellen Adenin-RNA-Schalters (2012)

Senada Nozinovic

Die Untersuchung von RNA mittels NMR-Spektroskopie hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, weil die Zahl der neu entdeckten RNA-Funktionen, wie z.B. RNA-Schalter in Bakterien, stark gestiegen ist. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe der NMR-Spektroskopie einen Beitrag zum besseren Verständnis der biochemischen Prozesse, in die RNA-Moleküle involviert sein können, zu leisten. Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2, 3 und 4) werden zum einen die Entwicklung neuer Methoden für die RNA-Strukturbestimmung vorgestellt und zum anderen die Leistungsfähigkeit der modernen NMR-spektroskopischen Strukturaufklärung demonstriert. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) wird die NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der RNA-Schalter-Funktion eingesetzt. Die biologische Funktion von RNA oder Proteinen setzt oftmals eine dynamische Struktur voraus und involviert Konformationsänderungen infolge biochemischer Signalweiterleitung. Für die Charakterisierung solcher Prozesse eignet sich die NMR-Spektroskopie insbesondere gut, weil sie in Lösung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen angewandt wer-den kann. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Basenpaarungen können wichtige strukturelle Eigenschaften (Faltung, Strukturhomogenität und Dynamik) entschlüsselt und in einen Zusammenhang mit der Funktion gebracht werden. Im Folgenden werden die einzelnen Kapitel vorgestellt. Nachdem das erste Kapitel eine allgemeine Einleitung in die NMR-Spektroskopie, RNA-Struktur und Funktion der RNA-Schalter darstellt, folgt im Kapitel 2 die Einführung einer neuen Methode, die eine quantitative Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta in RNA/DNA mittels NMR-Spektroskopie ermöglicht (Abb. 1). Sie basiert auf der Wechselwirkung zwischen dem CH-Dipol und der 31P-CSA, die von der relativen Orientierung abhängig ist. Die Methode wurde für die CH- und CH2-Gruppen in Form von zwei Pulssequenzen (2D- und 3D-G-HCP) zur Messung von insgesamt fünf kreuz-korrelierten Relaxationsraten entlang des RNA/DNA-Rückgrats optimiert. Die Funktionsfähigkeit der Methode wurde zunächst an der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA getestet und zur Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta genutzt. Die Ergebnisse flossen in die Strukturrechnung der 14mer RNA, die im Kapitel 3 vorgestellt wird, mit ein. Des Weiteren gelang es die Anwendbarkeit der Experimente an einer größeren 27mer RNA zu demonstrieren. Die neue Methode ist deswegen von Bedeutung, weil die Winkel alpha und zeta nicht über 3J-Kopplungskonstanten gemessen werden können. (Nozinovic, S., Richter, C., Rinnenthal, J., Fürtig, B., Duchardt-Ferner, E., Weigand, J. E., Schwalbe, H. (2010), J. Am. Chem. Soc. 132, 10318-10329.) Im Kapitel 3 wird die NMR-spektroskopische Bestimmung der Struktur einer Model-RNA, der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA, vorgestellt. Die Strukturrechung wurde mit verschiedenen NMR-Datensätzen, die in der Arbeitsgruppe einschließlich dieser Doktorarbeit gesammelt wurden, durchgeführt. Zusammen mit den Ergebnissen aus dem Kapitel 2 konnte eine sehr präzise Struktur mit einem RMSD von 0,37 Å (20 Strukturen) in sehr guter Übereinstimmung mit experimentellen Daten ermittelt werden. Die gerechnete Struktur repräsentiert eine der gegenwärtig genauesten und umfassendsten Strukturbestimmungen einer RNA, bei der jeder Torsionswinkel quantitativ bestimmt wurde. Einen besonderen Höhepunkt stellt die strukturelle Analyse der 2’OH-Gruppen dar, die im anschließenden Kapitel 4 weiter vertieft wurde. (Nozinovic, S., Fürtig, B., Jonker, H. R. A., Richter, C., Schwalbe, H. (2010), Nucleic Acids Res. 38, 683-694) Über Jahre war bekannt, dass die Größe der 1J(C1’,H1’)- und 1J(C2’,H2’)-Kopplungskonstanten innerhalb der Ribonukleotide von der lokalen Struktur des Zuckers und der Orientierung der Nukleobase beeinflusst wird. In dieser Arbeit (Kapitel 4) wurde zum ersten Mal ein systematischer Vergleich zwischen NMR-Messungen und DFT-Rechnungen durchgeführt, der eine eindeutige Zuordnung der Hauptkonformationen des Zuckers (C3’- oder C2’-endo) und der Nukleobase (anti oder syn) anhand der 1J(C,H)-Kopplungskonstanten erlaubt. Die beschriebene Methode wurde an einer größeren 27mer RNA erfolgreich erprobt. Weiterhin wurde erstmalig entdeckt, dass zudem die Orientierung der 2’OH-Gruppe einen signifikanten Einfluss auf die 1J(C,H)-Kopplungen hat (Abb. 3). Mithilfe von NMR-Messungen und DFT-Rechnungen konnte aus 1J(C,H)-Kopplungskonstanten die Orientierung von allen 2’OH-Gruppen in der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA bestimmt werden. Die Methode hat den großen Vorteil, dass 2’OH-Gruppen, die aufgrund des schnellen Austauschs mit Wasser oder D2O keine NMR-Signale liefern, analysiert werden kön-nen. (Nozinovic, S., Gupta, P., Fürtig, B., Richter, C., Tüllmann, S., Duchardt-Ferner, E., Holthausen, M. C., Schwalbe, H. (2011), Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5397-5400) Im Kapitel 5 wird eine NMR-spektroskopische Untersuchung an der Aptamerdomäne des Adenin-bindenden RNA-Schalters (pbuE) vorgestellt. Im Fokus der Forschung stand die Frage: Welchen Einfluss hat die Länge der P1-Helix auf die Struktur und die Ligandbindung der freien Aptamer-domäne? Durch den Vergleich von zwei Konstrukten mit unterschiedlich langer P1-Helix war es möglich, intrinsische Scherkräfte, die durch die Ausbildung der P1-Helix in der freien Aptamerdomäne entstehen, festzustellen. Es hat sich im Konstrukt mit der verlängerten P1-Helix gezeigt, dass diese zur Destabilisierung der P3-Helix und des Schlaufenkontakts führen. Diese strukturellen Änderungen haben außerdem zur Folge, dass die Bindungsstärke des Liganden reduziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass ein strukturelles Gleichgewicht zwischen Sekundärstrukturelementen die tertiäre Faltung beeinflusst und die Funktion moduliert. (Nozinovic, S., Reining, A., Noeske, J., Wöhnert, J., Schwalbe, H. (2011), in Vorbereitung)

Synthese und Koordinationsverhalten redoxaktiver chinoider Liganden (2012)

Florian Blasberg

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung, Synthese und Charakterisierung neuartiger redoxaktiver Liganden und deren Metallkomplexen. Basierend auf dem para- und ortho-Hydrochinon / Benzochinon-Redoxsystem wurden 13 neue Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden (28 – 36 und 67 – 70; Schema 47) synthetisiert und vollständig charakterisiert. Ein Schwerpunkt lag auf der Einführung von Substituenten am Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donor, um deren Einfluss auf das N,N′-Koordinationsverhalten gegenüber Metallionen zu untersuchen. In Analogie zu den klassichen Skorpionaten sind Substituenten in Position 3 der Pyrazolringe in der Lage, koordinativ ungesättigte Metallzentren kinetisch zu stabilisieren, was für potentielle Anwendungen in der Katalyse essentiell ist. Bei den ortho-chinoiden Liganden (67 – 70; Schema 47) erfüllt die redoxaktive Gruppe eine zweite Funktion, nämlich als Chelatdonor gegenüber Metallzentren, was die Synthese und Untersuchung (hetero-)dinuklearer Komplexe erlaubt. Schema 47: In dieser Arbeit synthetisierte und charakterisierte redoxaktive Bis(pyrazol-1-yl)methan- Liganden. Die kristallographische Charakterisierung von 10 dieser Liganden (28 – 33, 67 – 70) zeigte größtenteils sehr ähnliche strukturelle Parameter. Ein steigender sterischer Anspruch der Substituenten am Bis(pyrazol-1-yl)methan führte zu einer leichten Streckung der Chinon–Bis(pyrazol-1-yl)methan-Bindung und zu kurzen Kontakten zwischen Substituenten am zentralen Methin-Kohlenstoffatom und den ipso- (HQ-C1) bzw. ortho-Kohlenstoffatomen (HQ-C2) am sechsgliedrigen Ring. Diese kurzen Kontakte spielten in der oxidativen Demethylierung von 32 eine Rolle. Während alle anderen para-chinoiden Liganden mit Cerammoniumnitrat (CAN) zu den erwarteten para-Benzochinon-Derivaten reagierten (Schema 48), wurde im Zuge der Oxidation von 32 ein zusätzliches Sauerstoffatom am sechsgliedrigen Ring eingeführt (47; Schema 48). Im Gegenzug wurde die sterisch am stärksten abgeschirmte Methoxygruppe nicht oxidativ demethyliert. Letztendlich konnte gezeigt werden, dass (i) das neu eingeführte Sauerstoffatom von atmosphärischem Sauerstoff stammt und (ii) alle fünf Methylgruppen und beide Methoxygruppen in 32 für die Oxidation essentiell sind. Zusammenfassung 72 Schema 48: Oxidation der para-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden mit CAN. Die Cyclovoltammogramme der ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden (untersucht am Beispiel von 67, 68 und 70) zeigten irreversible Redoxwellen, da im Zuge der Oxidation OH-Protonen abgespalten wurden; die Redoxpotentiale liegen in einem mit chemischen Oxidationsmitteln gut zugänglichen Bereich. 70 wurde von CAN erfolgreich oxidiert, das Produkt 71 zersetzte sich unter den Reaktionsbedingungen allerdings sehr schnell und konnte nicht isoliert, sondern lediglich als Additionsprodukt von 4-tert- Butylpyridin abgefangen werden. Unter optimierten Reaktionsbedingungen und mit DDQ als Oxidationsmittel ließen sich 70 und 68 in ihre oxidierte Form überführen und in Reinform gewinnen. Die für ortho-Benzochinone typische Neigung zur Zersetzung wurde auch bei 71 und 73 beobachtet, wobei letzteres sich wesentlich schneller zersetzte (innerhalb von Stunden) als 71 (innerhalb eines Tages). Abb. 36: N,N′-Cobalt- und Palladium-Komplexe 59, 60, 74 und 75. Die Koordinationschemie repräsentativer Vertreter der 13 redoxaktiven Bis(pyrazol-1- yl)methan-Liganden wurde untersucht. Bereits der sterisch nur mäßig anspruchsvolle parachinoide Ligand 29 ist in der Lage, koordinativ ungesättigte CoII-Ionen kinetisch gegenüber der Bildung von 1:2 Komplexen zu stabilisieren. Im Festkörper liegen ausschließlich Verbindungen mit einer 1:1 Zusammensetzung von Ligand zu CoII vor (59 und 60; Abb. 36). In Lösung scheinen hingegen Gleichgewichte zu existieren, in denen auch die koordinativ abgesättigten oktaedrischen 2:1 Komplexe auftreten. Die ortho-chinoiden Liganden 67 und 68 bildeten selektiv entsprechende N,N′-koordinierte PdCl2-Komplexe, ohne dass das ortho- Hydrochinonat (Catecholat) als konkurrierender O,O′-Donor wirkte (74 und 75). Zusammenfassung 73 Es zeigte sich jedoch auch, dass sterisch sehr anspruchsvolle Substituenten am Bis(pyrazol-1-yl)methan-Fragment in Reaktionen mit Übergangsmetallen zu einer Zersetzung des Ligandengerüsts führen können. So reagierte der para-chinoide tert-Butyl-substituierte Ligand 31 mit [Co(NO3)2] zu [(HpztBu,H)2Co(NO3)2] (63). Eine analoge Zersetzung zu trans- [(HpzR,H)2PdCl2] (76: R = Ph und 77: R = tBu) wurde nach der Reaktion der ortho-chinoiden Liganden 69 bzw. 70 mit [PdCl2]-Quellen beobachtet. Schema 49: Synthese von O,O′-Koordinationskomplexen der ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1- yl)methan-Liganden 68, 69 und 70. Die ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden (67 – 70) besitzen mit ihrem Catecholat-O,O′-Donor eine zweite Koordinationsstelle, was diese Liganden für die Synthese von dinuklearen Komplexen interessant macht. Da gezeigt werden konnte, dass [PdCl2] selektiv an den Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donor koordiniert (vgl. 59, 60, 74 und 75; Abb. 36), galt es als nächstes zu evaluieren, ob eine ähnlich selektive Bindung anderer Metallionen an den O,O′-Donor möglich ist. Abb. 37: Molekulare Strukturen ausgewählter O,O′-Koordinationskomplexe ortho-chinoider Bis(pyrazol-1-yl)methan-Komplexe 82 (links), 83 (Mitte) und 85 (rechts). In der Tat konnten in sehr guten Ausbeuten O,O′-gebundene [(p-cym)Ru]-, [(Phpy)2Ir]- und [(Cp*)Ir]-Komplexe ausgewählter redoxaktiver ortho-chinoider Liganden dargestellt werden. Vorteilhaft war die Verwendung der kristallinen, nicht-flüchtigen Base TlOtBu zum Abfangen der im Zuge der Komplexierung freiwerdenden Protonen (Schema 49, Abb. 37). Die Eliminierung von TlCl sorgt für eine irreversible Reaktion zu den entsprechenden Zusammenfassung 74 Komplexen. Besonders interessant ist die Koordinationschemie des Liganden 68 im chiralen, anionischen IrIII-Komplex 83 (Abb. 37 Mitte), der in der Synthese als Thallium-Salz anfiel und im Festkörper TlI-verbrückte Dimere bildete. Eine elektrochemische Charakterisierung wurde mit 85 durchgeführt. Wie erwartet, zeigte der komplexierte Bis(dimethylpyrazol-1-yl)methan-Ligand im Gegensatz zu freiem 68 eine reversible Oxidationswelle. Die Potentialdifferenz zwischen Liganden-Oxidation und Iridium- Reduktion beträgt fast 2 V, was in diesem Zusammenhang bedeutet, dass sich 68 als unschuldiger Ligand verhält und man Iridium zweifelsfrei die Oxidationsstufe +III zuweisen kann. Mit Komplexen von 68 und leichter reduzierbaren Übergangsmetallen sollte es hingegen möglich sein, in den Bereich des nicht-unschuldigen Verhaltens vorzudringen und z.B. Valenz-Tautomerie zu beobachten. Mit effizienten Synthesewegen zu N,N′-Komplexen einerseits (74 und 75; Abb. 36) und O,O′-Komplexen andererseits (u.a. 83 und 85; Abb. 37) wurde als nächstes ein heterodinuklearer Komplex synthetisiert (87; Schema 50). 68 erwies sich als am besten geeigneter Ligand, da er, wie bereits erwähnt, eine gute Löslichkeit bei moderatem sterischen Anspruch besitzt und der N,N′-Donor auch in Gegenwart von Lewis-sauren Metallionen beständig ist. Die Wannenform des Bis(pyrazol-1-yl)methan-PdII-Chelatrings in 87 bringt das Palladium- Ion in räumliche Nähe zum ortho-Hydrochinonat π-System. In früheren Studien dieser Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass ein solches Arrangement Elektronenübertragungen zwischen dem Chinon und dem koordinierten Palladium-Zentrum erlaubt. Durch die direkte konjugative Wechselwirkung des zweiten Metallzentrums (IrIII) mit der redoxaktiven Gruppe über die Sauerstoffatome in 87 sollte eine effektive elektronische Ligand ↔ Metall- und Metall ↔ Metall-Kommunikation möglich sein. Die elektrochemische Charakterisierung zeigte allerdings, dass im vorliegenden Fall die Potentiale der drei Komponenten Chinon / PdII / IrIII mit jeweils ca. einem Volt zu weit auseinander liegen. Schema 50: Synthese eines hetero-dinuklearen IrIII/PdII-Komplexes. Im letzten Teilgebiet dieser Arbeit wurde die Eignung der ortho-chinoiden Liganden 67 und 70 für den Aufbau höhermolekularer Koordinationsverbindungen und oligonuklearer Aggregate untersucht. Zusammenfassung 75 Schema 51: Synthese der oktaedrischen Komplexliganden 89 – 96. Dafür wurden Komplexliganden synthetisiert, die aus einem Zentralmetall bestehen, das oktaedrisch von je drei O,O′-koordinierenden Liganden 67 bzw. 70 umgeben ist (Schema 51). Mit den freien Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donorgruppen vermag jeder dieser Komplexliganden drei weitere Metallzentren zu koordinieren. Derartige Verbindungen könnten aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur z.B. Anwendung im Aufbau von redoxaktiven metallorganischen Netzwerken oder elektrisch leitfähigen Koordinationspolymeren finden. Als Zentralmetalle dienten FeIII- und AlIII-Ionen; erstere, weil sie selbst redoxaktiv sind, und letztere, weil sie eine im Vergleich zu FeIII ähnliche Koordinationschemie besitzen, aber wegen ihres Diamagnetismus‘ eine NMR-spektroskopische Charakterisierung ermöglichen. Je nach verwendeter Base wurden die dreifach anionischen Komplexliganden als Lithium- bzw. Thallium-Salze isoliert. Die NMR-Spektren von 89, 90, 93 und 94 zeigten jeweils nur einen Signalsatz, obwohl sich, bedingt durch die Asymmetrie des Liganden und die Chiralität des oktaedrischen Metallzentrums, fac- und mer-Isomere bilden können. Es konnte nicht abschließend geklärt werden, ob sich exklusiv das höhersymmetrische fac-Isomer bildet, oder ob ein Mechanismus aktiv ist, der alle Isomere auf der NMR-Zeitskala schnell ineinander überführt, sodass die Gegenwart lediglich einer Spezies vorgetäuscht wird. In elektrochemischen Untersuchungen zeigten die Komplexliganden mehrere irreversible Oxidationswellen. Ob dieses Verhalten auf eine intramolekulare Kommunikation der einzelnen redoxaktiven Gruppen zurückzuführen ist, müssen weitergehende Studien zeigen. Als prinzipieller Beleg für die präparative Anwendbarkeit der Komplexliganden und Grundlage für die Untersuchung der Koordinationschemie der oktaedrischen Komplexliganden, wurden PdII-Komplexe von 89 und 93 synthetisiert.

An ambiguous interface – on the transport mechanism of the ABC transport complex TAP (2012)

Nina Großmann

The adaptive immune system protects against daily infections and malignant transformation. In this, the translocation of antigenic peptides by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the ER lumen is an essential step in the antigen presentation by MHC I molecules. The heterodimeric ATP-binding cassette transporter (ABC) TAP consist of the two halftransporters TAP1 and TAP2. Each monomer contains an N-terminal transmembrane domain (TMD) and a conserved C-terminal nucleotide-binding domain (NBD). Together, the TMDs build the translocation core and the NBDs bind and hydrolyze ATP, energizing the peptide transport. TAP features an asymmetry in the two ATP-binding sites that are built of several conserved motifs. One motif is the D-loop with the consensus sequence SALD. The highly conserved aspartate of the D-loop of TAP1 reaches into the canonic ATP-binding site and contacts the Walker A motif and the H-loop of the opposite NBD, while the Asp of D-loop of TAP2 is part of the non-canonic ATP-binding site. To examine this ABC transport complex in mechanistic detail, a purification and reconstitution procedure was established with the function of TAP being preserved. The heterodimeric TAP complex was purified via a His10-tag at TAP1 in a 1:1 ratio of the subunits. Nucleotide binding to the purified transporter was elucidated by tryptophan quenching assays and the affinity constants for MgADP and MgATP were determined to be 1.0 μM and 0.7 μM, respectevely. In addition, the TAP complex shows strict coupling between peptide binding and ATP hydrolysis, revealing no basal ATPase activity in the absence of peptides. Furthermore, TAP was reconstituted into proteoliposomes and the activity was tested by peptide transport and ATP hydrolysis. Interestingly, the kinetic parameters of the transporter in the reconstituted state are comparable to the data gained for TAP in microsomes. To characterize the functional importance of the D-loop, D-loop mutants of either TAP1 or TAP2 were analyzed. Strikingly, TAP containing a mutated D-loop in TAP1 (D674A) shows an ATP-hydrolysis independent peptide translocation. Accordingly, the MHC I surface expression is similar to the wildtype situation. However, the same mutation in TAP2 (D638A) results in an ATPase dependent peptide transport similar to wildtype, whereas TAP containing mutations in both subunits leads to an inactive transporter. Although all D-loop mutants showed no altered peptide binding activity, the TAP1 mutant is inactive in peptide-stimulated ATPase activity. Strikingly, ATP or ADP binding is strictly required for the peptide translocation. Experiments carried out in proteoliposomes demonstrate that wildtype TAP can export peptides against their gradient when low peptide concentrations are offered. In contrast, the D674A mutant can facilitate peptide translocation along their concentration gradient in the two directions. At high peptide concentrations, TAP is trapped in a transport incompetent state induced by trans-inhibition. In conclusion, a TAP mutant that uncouples solute translocation from ATP hydrolysis was created. Since this passive substrate movement is strictly dependent on binding of ATP or ADP, an active transporter was turned into a “nucleotide-gated facilitator”. In a cysteine cross-linking approach the conformational changes of TAP during peptide transport and the flexibility of the nucleotide binding domains were examined. Single cysteines were introduced in the D-loops of TAP1 and TAP2. Cross-linking by copper-phenantroline (CuPhe) was possible for all combinations. However, by adding ATP, ADP or peptide to the TAP complex no differences in the cross-linking efficiency were detected. By CuPhe cross-linking TAP was trapped in a conformation, in which the peptide binding site was not accessible. To complete a transport cycle, a flexibility of at least 17.8 Å of the NBDs is needed, since TAP cross-linked by CuPhe (2.0 Å) or bismaleimidoethane (BMOE, 8.0 Å) was transport inactive but when TAP was cross-linked by 1,11-bismaleimido-triethyleneglycol (BM[PEG]3, 17.8 Å) transport activity was preserved.

Das humane endogene Retrovirus-K: Grundlagenforschung und Nutzen als Tumor-assoziiertes Antigen (2011)

Benjamin Kraus

Fast die Hälfte des humanen Genoms besteht aus Retroelementen, die während der evolutiven Entwicklung des Menschen im Genom fixiert wurden. Im Wesentlichen kann man diese Retroelemente in DNA-Transposons, LINEs, SINEs und humane endogene Retroviren unterteilen, dabei nehmen die humanen endogenen Retroviren (HERV) 8% des humanen Genoms ein. Bei einer Unterfamilie, der HERV-K Familie, sind bis heute alle offenen Leserahmen erhalten geblieben. Nach heutigem Erkenntnisstand wird eine Expression dieser Elemente in somatischen Zellen jedoch strikt unterdrückt, denn eine Expression von Retroelementen könnte zu Insertionsmutagenesen führen und letztlich dem Organismus erheblichen Schaden zufügen. Im Gegensatz dazu wird eine reaktivierte Expression von HERV-K häufig in einigen Tumorarten beobachtet: allen voran Keimzelltumore, Melanome und Brustkrebs. Außerdem können in Patienten, die an solchen Tumoren erkranken, häufig HERV-K spezifische Antikörper und mitunter auch gegen HERV-K-gerichtete T-Zellen nachgewiesen werden. Die strikte Unterdrückung der HERV-K Expression in gesunden, somatischen und eine reaktivierte Expression in entarteten Zellen machen HERV-K Proteine daher zu idealen Tumor-assoziierten Antigenen. Auf Grundlage dieser Untersuchungen wurden, in dieser Arbeit, zwei potentielle Tumorvakzine, basierend auf dem hoch attenuierten Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) hergestellt. Durch homologe Rekombination wurde ein HERV-K gag-pro-pol transgenes MVAHKcon und ein HERV-K env transgenes MVAHKEnv hergestellt und charakterisiert. Darüber hinaus wurden die rekombinanten Viren in einem neu etablierten, syngenen Maus-Tumor-Modell untersucht. MVAHKcon immunisierte Mäuse zeigten eine starke humorale Immunantwort und waren in der Lage subkutane, HERV-K Gag positive Tumore fast vollständig zu eliminieren. MVAHKEnv immunisierte Mäuse zeigten dagegen eine moderate humorale Immunantwort und eine starke T-Zellantwort. Nach therapeutischer Immunisierung mit MVAHKEnv konnte im Mausmodell eine signifikante Reduktion an HERV-K Env positiven Lungenmetasten beobachtet werden. Außerdem konnte durch eine prophylaktische Immunisierung mit MVAHKEnv ein vollständiger Schutz der Mäuse vor der Ansiedlung HERV-K Env-exprimierender Tumore erreicht werden. Die hier vorgestellten HERV-K rekombinanten MVA könnten daher der erste Schritt zu einer Immuntherapie gegen reaktivierte Retroelemente in malignen Tumoren darstellen. MVAHKcon infizierte Zellen produzieren und sekretieren große Mengen HERV-K Virus-ähnlicher Partikel (VLP) somit konnten auch grundlegende Fragestellungen der HERV-K Biologie geklärt Zusammenfassung 123 werden. Durch die Kombination massenspektrometrischer Analysen und N-terminaler Sequenzierungen konnten, die noch nicht bekannten Schnittstellen der retroviralen Protease im HERV-K Gag Protein identifiziert werden. Zudem wurde eine späte Domäne von HERV-K identifiziert und darüber hinaus Wechselwirkungen von HERV-K VLPs mit zellulären Restriktionsfaktoren wie APOBEC3G und CD317 studiert.

A NMR-based study on the characteristics of nonnative hen and human lysozyme and their disease-related mutants (2011)

Friederike Sziegat

Methoden zur Konformationsbestimmung an Peptiden und Nukleinsäuren mittels skalarer und dipolarer Kopplungen (2012)

Daniel Mathieu

Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an GXG Modellpeptiden konnten eindeutig zeigen, dass diese Peptide, auch ohne das Vorhandensein von langreichweitigen Wechselwirkungen, bestimmte Sekundärstrukturen präferieren. Ein Teil der beobachteten, auftretenden Strukturmotive lässt sich hierbei über den sterischen Anspruch der Seitenkette erklären, ein anderer Teil über die Ladung der Seitenkette. In Kombination mit anderen Spektroskopischen Methoden konnten zehn dieser Peptide genauestens untersucht werden. Hierbei zeigte sich, dass diese Peptide nicht nur die favorisierten Regionen des Ramachandran-Diagramms besetzen. Ein Vergleich mit dem Vorkommen bestimmter Aminosäuren, beispielsweise in loop Regionen von Proteinen, zeigt dass die Sequenz dieser loops nicht zufällig ist. Tatsächlich besitzt ein Teil der Aminosäuren, die besonders häufig an bestimmten loop Positionen vorkommen, bereits die intrinsische Vorliebe, die notwendige Konformation einzunehmen. Diese Aminosäuren und die umgebenden loops sind somit eventuell nicht nur das simple Verbindungsglied zwischen zwei Sekundärstrukturen, sondern kommen selbst als Ausgangspunkte für Peptid- bzw. Proteinfaltung in Frage. Ein weiteres Augenmerk der Arbeit lag auf der Messung von skalaren und dipolaren Kopplungen an isotopenmarkierter RNA. Es wurden vier Pulssequenzen entwickelt, die es ermöglichen, 1J skalare bzw. dipolare Kopplungen in der Zuckerregion von 13C- markierter RNA mit hoher Präzision zu messen. Die entwickelten J-modulierten Experimente ermöglichen die Messung von 1J(H2’C2’), 1J(C1’C2’) sowie 1J(C2’C3’) Kopplungen selbst für größere RNA Moleküle. Die Detektion erfolgt hierbei auf den C1’H1’ Signalen, die Zuordnung der Kerne, deren Kopplung gemessen wird, ist nicht einmal erforderlich. Die Anwendbarkeit konnte für verschiedene Systeme mit 14 bis 70 Nukleotiden demonstriert werden. Die erreichte Präzision ermöglichte es außerdem auch sehr kleine Effekte, wie beispielsweise die Ausrichtung von RNA im Magnetfeld zu detektieren. Diese Arbeit zeigt außerdem zwei Beispiele für die gezielte Modifikation, um Lanthanid Bindungsstellen einführen zu können. Auf chemischen und biochemischen Weg konnte isotopenmarkierte, in vitro transkribierte RNA modifiziert werden. Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine Bindung von Lanthanid-Ionen an die modifizierte RNA. Die auftretenden, eher kleinen Effekte, sind vermutlich auf die noch zu hohe Flexibilität der eingeführten Modifikationen. Vor allem bei der chemischen Modifikation besteht hier noch Potential zur Optimierung, nachdem die generelle Anwendbarkeit der Methode demonstriert wurde. Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse von Kopplungsmustern zur Analyse und zum Vergleichen von Naturstoffen. Hier konnten aus einer Reihe von Derivaten eindeutig die identifiziert werden, die verglichen mit der Ausgangsstruktur, die gleiche Konformation besitzen. Die gewonnenen Ergebnisse decken sich hier mit durchgeführten biologischen Tests, die ebenfalls dasselbe Derivat als aktiv identifizieren konnten, was klar für eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung spricht. In der vorliegenden Arbeit werden Methoden und Anwendungen gezeigt, um skalare und dipolare Kopplungen im Bereich von Peptiden, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen zu nutzen. Die durchgeführten Arbeiten reichen dabei von der speziellen Probenpräparation zur Messung von dipolaren Kopplungen bis hin zur Entwicklung neuer NMR-spektroskopischer Methoden zur Messung von Kopplungen mit höherer Präzision und an größeren Systemen als bisher.

Kurzzeitspektroskopische Untersuchungen an Flavoproteinen: Photoprotektion von Flavinen in Dodecinen und erste Schritte der Peptidfaltung (2012)

Heike Staudt

Zusammenfassung Ziel dieser Arbeit war es zum einen Informationen über den Mechanismus in Dodecinproteinen zu gewinnen, der zu der effizienten Fluoreszenzlöschung von gebundenem Riboflavin und einer deutlichen Verlängerung der Lebendsdauer des Chromophors unter Lichteinwirkung führt. Zum anderen sollte mit Hilfe eines kurzen Modellpeptids, das eine Azobenzoleinheit als Photoschalter in seinem Peptidrückgrat enthielt, erste Schritte der Peptidfaltung untersucht werden. Die Untersuchungen an Dodecinproteinen konzentrierten sich hauptsächlich auf archaeales Dodecin aus Halobacterium salinarum (HsDod). Eine Besonderheit der Dodecinproteine ist, dass sie im Gegensatz zu anderen Flavinbindeproteinen zwei Flavinmoleküle in jeder ihrer sechs identischen Bindetaschen einbauen können. Kurzzeitspektroskopische Untersuchungen im UV/vis-Spektralbereich zeigen, dass nach Photoanregung eines gebundenen Riboflavinmoleküls nach etwa 10 ps der Ausgangszustand wieder erreicht wird. Weiterhin zeigt das Fehlen der stimulierten Emission in den transienten Daten, dass bereits innerhalb der Zeitauflösung des Experiments, in weniger als 150 fs, der erste angeregte Zustand des Riboflavins entvölkert wird. Dies verhindert unerwünschte Reaktionen des Riboflavins und stellt eine Versorgung der Zelle mit diesem wichtigen Baustein für die Biosynthese von FMN und FAD sicher. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass zwei Spezies mit unterschiedlichen spektralen Signaturen und Lebensdauern an dem Löschungsmechanismus und der Wiedererlangung des Ausgangszustands beteiligt sind. Der Vergleich von HsDod-Proteinen in nicht-deuteriertem und deuteriertem Lösungsmittel sowie die spektrale Signatur der Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 800 fs zerfällt deuten an, dass ein Elektronen- sowie ein Protonentransfer Teil des Mechanismus sind. Mit Hilfe von HsDod-Proteinen, bei denen der Asparaginsäurerest unterhalb der Bindetasche, der für das Binden eines wasserkoordinierten Magnesiumions verantwortlich ist, gegen Serin (D41S) oder Glutaminsäure (D41E) ausgetauscht war, konnte gezeigt werden, dass das wasserkoordinierte Magnesiumion nicht relevant für den Löschungsmechanismus ist. Dennoch konnte eine Beteiligung von Wassermolekülen nicht ausgeschlossen werden. Die Beteiligung eines Elektronentransfers von einem Tryptophanrest in der Bindetasche auf das photoangeregte Flavin konnte durch Messungen an Dodecinproteinen mit Tryptophan-Derivaten mit unterschiedlichen Ionisationsenergien bestätigt werden. Die Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 5 ps zerfällt, die ebenfalls zu einer Wiederbesetzung des Ausgangszustands führt, konnte nicht eindeutig identifiziert werden. Die spektrale Signatur des zerfallassoziierten Spektrums könnte neben einer neutralen Tryptophanspezies und einem kationischen Riboflavinradikal auch durch schwingungsangeregte Riboflavinmoleküle verursacht werden. Eine Beteiligung der Ribitylkette am Mechanismus kann aufgrund der Ergebnisse von HsDod-gebundenem Lumiflavin ausgeschlossen werden. Weiterhin konnte anhand der Ergebnisse für HsDod-gebundenes FAD, das in seiner geschlossenen Konformation gebunden wird, wobei der Adeninrest die zweite Position in der Bindetasche besetzt, eine Beteiligung des zweiten Flavins in der Bindetasche am Löschungsmechanismus sowie ein Beitrag zu den Differenzspektren ausgeschlossen werden. Somit dient die Besetzung einer Bindetasche mit zwei Flavinmolekülen vermutlich lediglich der Maximierung der Flavinbeladung. Nicht eindeutig geklärt werden konnte die Frage, ob es sich um einen sequentiellen oder parallelen Mechanismus handelt. Neben archaealem wurde auch bakterielles Dodecin mittels transienter UV/vis-Spektroskopie untersucht. Für Dodecin aus Halorhodospira halophila (HhDod) konnte ebenfalls eine sehr schnelle Wiedererlangung des Ausgangszustands nach Photoanregung des gebundenen Riboflavins beobachtet werden. Allerdings spiegeln einige Unterschiede in den transienten Daten die Unterschiede in den Bindetaschen von archaealem und bakteriellem Dodecin wider und geben Hinweise darauf, dass die Funktionen in der Zelle für die Dodecine unterschiedlich sind. Diese Hypothese wird durch verschiedene Cofaktoren, Riboflavin und Lumichrom für HsDod und FMN für HhDod, in vivo unterstützt. Die ermittelten Zeitkonstanten sind für das bakterielle Dodecin etwas länger als für das archaeale und die transienten Daten weisen in den spektralen Signaturen der Differenzsignale sowohl Unterschiede als auch Gemeinsamkeiten auf. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden erste Schritte der Peptidfaltung mit Hilfe eines wasserlöslichen bizyklischen Modellpeptids, das den Photoschalter 4(4’-Aminomethylphenylazo) benzoesäure (AMPB) enthält, untersucht. Hierfür wurden Kurzzeitspektroskopische Messungen im mittleren infraroten Spektralbereich für den Schaltvorgang von der cis- Form des Azopeptids in die trans-Form durchgeführt. Diese Methode erlaubt es, transiente Konformationsänderungen des Peptidrückgrats zu verfolgen. In der cis-Form kann das Peptid mehrere unterschiedliche Konformationen einnehmen, während der Konformationsraum für die trans-Form deutlich eingeschränkt ist. Nach der Photoanregung im Bereich der n-pi*-Bande der Azobenzoleinheit finden die grundlegenden konformationellen Änderungen innerhalb der ersten 10-20 ps statt. Dies wurde durch polarisationsabhängige Messungen bestätigt. Auf dieser Zeitskala finden die größten Änderungen in den transienten Differenzspektren statt, die auf Konformationsänderungen sowie Kühlprozesse zurückzuführen sind. Diese Prozesse konnten mit einer Zeitkonstanten von 5 ps zusammengefasst werden. Auf längeren Zeitskalen finden weitere Reorganisationsprozesse statt, die mit einer Zeitkonstante von 300 ps zusammengefasst werden können. Bei maximaler Verzögerungszeit des Experiments (1,8 ns) ist der Gleichgewichtszustand noch nicht erreicht und es finden weitere Prozesse auf längeren Zeitskalen statt. Im Vergleich zu einem ähnlichen bereits untersuchten DMSOlöslichen bizyklischen AMPB-Peptid konnte keine schnellere Dynamik durch den Einsatz von Wasser als Lösemittel festgestellt werden, wie es vorangegangene transiente Experimente im UV/vis-Spektralbereich an wasser- und DMSO-löslichen bizyklischen Azopeptiden angedeutet hatten. Die Ergebnisse der transienten Messungen zeigen gute Übereinstimmungen mit molekulardynamischen Rechnungen. Das so gewonnene Modell von den Prozessen nach der Isomerisierung des Photoschalters erlaubt Einblicke in erste Schritte bei der Faltung von Peptiden in ihrem natürlichen Lösungsmittel Wasser und die Zeitskalen der entsprechenden Prozesse.

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